bcr-abl融合基因抑制K562细胞凋亡的研究

目的研究ｂｃｒａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病细胞（ＣＭＬ）凋亡调控中的作用。方法用人工合成的与ｂｃｒａｂｌｍＲＮＡ（ｂ３ａ２型）融合点碱基序列互补的反义寡聚脱氧核苷酸（ＡＳＯＤＮ）作用于体外培养的ＣＭＬ细胞株Ｋ５６２细胞,观察Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果ｂｃｒａｂｌ融合基因表达受抑后,Ｋ５６２细胞凋亡显著增加。结论ｂｃｒａｂｌ融合基因可抑制ＣＭＬ细胞凋亡,这可能是ＣＭＬ发病的主要机制。     

前列腺凋亡反应基因4反义寡核苷酸抑制谷氨酸诱导的PC12细胞内钙离子浓度上调及其抗凋亡意义

目的　研究前列腺凋亡反应基因4(par -4)反义寡核苷酸拮抗谷氨酸对PC12细胞内游离钙离子浓度的上调作用及其抗凋亡意义。方法　脂质体介导转染par -4反义寡核苷酸。谷氨酸诱导PC12细胞凋亡。Hoechest33258 /碘化丙啶荧光染色观察细胞凋亡形态,流式细胞术分析凋亡百分率。Fura 2 /AM荧光染色结合激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度。逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)测定钙依赖性蛋白酶Calpain10的mRNA水平。Western印迹测定par -4蛋白表达量。结果与正常对照组(25 .6±4.1 )相比,谷氨酸诱导PC12细胞中par- 4蛋白表达上调( 90. 0±3 2,P<0. 01),par- 4反义寡核苷酸拮抗其上调( 52 .3±5 .0,P<0 .01 );谷氨酸诱导凋亡组凋亡百分率为53%, par -4反义寡核苷酸拮抗谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡(31%,P<0. 01);谷氨酸诱导PC12细胞内游离钙离子浓度上调,par- 4反义寡核苷酸拮抗其上调(荧光强度比值分别为167 .9±32 .4、228. 8±36. 8,P<0 .01);谷氨酸诱导PC12细胞内钙依赖性蛋白酶Calpain10mRNA水平上调( 46 .3±3 .7 ),par- 4反义寡核苷酸抑制其上调(34 8±2 1,P<0 01 )。结论　par -4反义寡核苷酸拮抗谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与抑制细胞内游离钙离子浓度上调和抑制Calpain10基因转录有关。     

PKC-α、PKA-Ⅰ反义核酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞生长增殖的影响

目的 :探讨PKC -α和PKA -Ⅰ反义核酸 (asODN)对鼻咽癌CNE - 2Z细胞生长增殖的影响。方法 :分别用脂质体 (lipofectin ,LP)介导asODN转染鼻咽癌CNE - 2Z细胞。实验组 :① 0 0 1- 1 0 0 μmol/LPKC -αasODN ;②0 0 1- 1 0 0 μmol/LPKA -ⅠasODN ;③ 0 5 0 μmol/LPKC -αasODN +0 5 0 μmol/LPKA -ⅠasODN。对照组 :相应浓度的随机序列 (rODN)。用免疫组化法检测CNE - 2Z细胞PKC -α和PKA -Ⅰ的表达 ,MTT法检测其生长指数 (growthin dex ,GI) ,软琼脂克隆形成率检测其体外增殖能力。结果 :PKC -αasODN或 /和PKA -ⅠasODN均可阻断其相应PKC-α或PKA -Ⅰ的表达 (P <0 0 5 )。PKC -αasODN或PKA -ⅠasODN均能显著降低CNE - 2Z细胞GI和软琼脂克隆形成率 (P <0 0 5 ) ,且具有量效依赖关系。PKC -αasODN +PKA -ⅠasODN共同作用可使其GI和软琼脂克隆形成率非常显著降低 (P <0 0 1) ,无明显量效依赖关系 ,两者对CNE - 2Z生长抑制作用强于PKC -αasODN或PKA -Ⅰa sODN(P <0 0 5 ) ,对其软琼脂克隆形成率的抑制作用与PKC -αasODN或PKA -ⅠasODN无显著差异 (P >0 0 5 )。结论 :PKC -αasODN和PKA -ⅠasODN均可抑制CNE - 2Z细胞体外生长和增殖 ,两者具有协同作用。     

hTERT基因反义核酸提高原代复发急性淋巴细胞白血病细胞对顺铂敏感性的研究

目的：研究人类端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的反义核酸（AS PS-ODN）能否增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。 方法:采用免疫荧光标记法检测hTERT蛋白表达水平，以台盼蓝拒染法计数细胞数，通过细胞形态学观察及流式细胞仪细胞周期的分析来检测凋亡。 结果:hTERT基因反义核酸能降低hTERT蛋白的表达。顺铂与hTERT基因反义核酸联合应用能明显抑制培养原代细胞的增殖，与单用顺铂组比较P<0.05。凋亡检测，用药48 h后，单用顺铂、顺铂联用反义核酸或正义核酸组，经Hoechst33258和PI双染法观察细胞均表现典型的细胞凋亡的形态学改变；顺铂联用反义核酸组，细胞的凋亡率明显高于单用顺铂组（P<0.05）。 结论:hTERT基因反义核酸能增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。     

Effect of nuclear factor-κB p65 ASOND on I typ collagen expression and rat hepatic stellate cells proliferation

Objective Sstudy effect of nuclear factor-κB ASOND on I type collagen expression and rat hepatic stellate cells(HSC)proliferation.Methods Rat HSCs were separated by affusing and digestingof Ⅳ type collagenenzyme and density acentric method.Lipid-mediated NF-κB p65 ASOND(0.001,0.01,0.1,1μmol/L)Was transferred into rat HSCs.Toxicity of HSCs caused by NF-κB p65 ASOND and activity of LDH were determined by trypan blue staining.Proliferation affection of transferring NF-κB p65 ASOND into HSCs was determined by MTT.In different concentration NF-κB p65 ASOND.expression of Ⅰ type collagen stimulated by 1mg/L TNF-αwas determined by RT-PCR and ELISA.Results After transfection of NF-κB p65 ASODN,expression of NF-κB protein in HSCs was decreasing.Toxicity experiment indicated that NF-κB p65 ASOND of different concentration(0.001,0.01,0.1 and 1.0 μmol/L)had no effect on HSCs livability and LDH activity(P<0.05).Four different concentration NF-κ B p65 ASOND could restrain HSCs proliferation stimulated by 1 mg/L TNF-α.The expression of I type collagen and mRNA stimulated by 1mg/LTNF-αwas increased,and had a positive correlation with concentration(P>0.05).Conclusion NF-κB p65 ASOND may depress NF-κB activity to restrain HSCs proliferation and Ⅰ type collagen expression,and reduce extracellular matrix.     

N-copine基因反义核酸对原代培养的小鼠皮质神经元的影响

目的：通过研究N-copine基因反义核酸(ant isense)对体外培养的小鼠大脑皮质神经元的影响，在细胞学层面上探索N-copine基因的功 能。 方法： 原代培养小鼠大脑皮质神经元，用反义核酸抑制N-copine基 因的表达，分析抑制N-copine基因表达对神经元生长及死亡的影响。 结果：寡核苷酸处理72 h，antisense组神经元轴突长度短了而且胞体变小，而对照组神经元轴 突和胞体都正常生长；antisense组台盼蓝着色细胞明显多于对照组，培养液中LDH活力明显 高于 对照组。 结论： 抑制N-copine基因表达，能影响体外培养的皮质神经元 的生长，并导致神经元严重损伤和死亡。这提示N-copine可能是神经元的一种保护性蛋白， 可能具有防止神经元退变和促进再生的重要作用。     

血管平滑肌细胞体外摄取寡核苷酸探针的研究

目的:以99mTc标记针对c-myc和bcl-2 mRNA的寡核苷酸并检测其在血管平滑肌细胞(VSMC)中的摄取情况,初步探讨其在粥样硬化病变中的诊断价值。方法99mTc标记寡核苷酸后分别加入体外培养对数生长期及平台期猪冠状动脉VSMC,37℃条件下温育,检测不同时段摄取百分数。结果:增殖期或平台期VSMC对bcl-2探针的摄取均低于对c-myc探针的摄取。在c-myc探针组,增殖期细胞较平台期摄取高反义探针较正义探针摄取高。结论:增殖期VSMC对c-myc反义探针的摄取增高和(或)对bcl-2反义探针的摄取减少,有望成为粥样病变的早期诊断指标。     

共有序列寡核苷酸竞争结合NF-κB以减少TNF产生的实验研究

目的:了解使用含核因子-κB(NF-κB)结合位点序列的共有序列寡核苷酸在胞浆内与NF-κB结合,以减少LPS刺激TNF产生的效果。方法:直接将经硫代磷酸修饰的寡核苷酸导入大鼠腹腔巨噬细胞,以减少细胞分泌产生肿瘤坏死因子(TNF)的效果作为判断指标,以ELISA法检测细胞培养上清液中的TNF-α含量。结果:加入具有NF-κB结合位点序列的共有序列寡核苷酸,可明显减少巨噬细胞受LPS刺激后所产生的TNF-α。结论:结果提示,具有NF-κB结合位点的共有序列寡核苷酸的使用,可在内毒素脂多糖(LPS)致病过程的中心环节上阻止或减轻LPS诱导的TNF-α的产生。     

制备脂质体包裹的99m锝标记c-myc mRNA反义寡聚核苷酸的研究

探讨脂质体包裹的 99m-锝标记 c- myc m RNA反义寡聚核苷酸的制备方法 ,为反义显像和反义治疗的实验研究奠定基础。合成 15 bp的反义寡聚核苷酸 (DNA)和双功能螯合剂 -联肼尼克酰胺衍生物 ,DNA与双功能螯合剂偶联后 ,用 99m锝标记 ,然后用 C1 8Sep- Pak反相柱进行纯化 ,根据纯化结果 ,绘制淋洗曲线 ,计算标记率。再用阳离子脂质体对纯化产物进行包裹 ,获得脂质体包裹的 99m锝 - DNA。用纸层析测定脂质体包裹的 99m锝 - DNA的放射性化学纯度及与水、血清孵育后的稳定性。结果 ,不同放射性活度的 99m Tc O4 - 标记时的标记率为 :14 80 MBq时为 6 3.37%± 3.5 1% ,74 0 MBq时为 6 2 .5 2 %± 3.6 9% ,5 92 MBq时为 5 9.82 %± 5 .12 % ,经 χ2检验无显著性差异。脂质体包裹 99m Tc- DNA的放射化学纯度 =96 .4 7%± 3.0 1% ,与水、血清孵育后脱落的 99m Tc极少 ,可见 99m Tc- DNA的稳定性极好。由此可见 ,以脂质体作载体 ,联肼尼克酰胺衍生物作为双功能螯合剂 ,可制备脂质体包裹的 99m锝标记的单链寡聚核苷酸     

Effect of nuclear factor-κB p65 ASOND on I typ collagen expression and rat hepatic stellate cells proliferation

Objective Sstudy effect of nuclear factor-κB ASOND on I type collagen expression and rat hepatic stellate cells(HSC)proliferation.Methods Rat HSCs were separated by affusing and digestingof Ⅳ type collagenenzyme and density acentric method.Lipid-mediated NF-κB p65 ASOND(0.001,0.01,0.1,1μmol/L)Was transferred into rat HSCs.Toxicity of HSCs caused by NF-κB p65 ASOND and activity of LDH were determined by trypan blue staining.Proliferation affection of transferring NF-κB p65 ASOND into HSCs was determined by MTT.In different concentration NF-κB p65 ASOND.expression of Ⅰ type collagen stimulated by 1mg/L TNF-αwas determined by RT-PCR and ELISA.Results After transfection of NF-κB p65 ASODN,expression of NF-κB protein in HSCs was decreasing.Toxicity experiment indicated that NF-κB p65 ASOND of different concentration(0.001,0.01,0.1 and 1.0 μmol/L)had no effect on HSCs livability and LDH activity(P<0.05).Four different concentration NF-κ B p65 ASOND could restrain HSCs proliferation stimulated by 1 mg/L TNF-α.The expression of I type collagen and mRNA stimulated by 1mg/LTNF-αwas increased,and had a positive correlation with concentration(P>0.05).Conclusion NF-κB p65 ASOND may depress NF-κB activity to restrain HSCs proliferation and Ⅰ type collagen expression,and reduce extracellular matrix.