miR-125b在儿童AML中的表达及其反义寡核苷酸对白血病细胞的作用

目的: 研究儿童急性髓细胞白血病(AML)患者骨髓细胞中miR-125b的表达及miR-125b为靶标的反义寡核苷酸对人白血病细胞的作用。方法: 采用基因芯片和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测儿童AML治疗前后骨髓细胞中miR-125b的表达。采用电转法将与miR-125b序列互补的反义寡核苷酸转染HL-60细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测转染后24 h、48 h、72 h、96 h细胞增殖情况。结果: 芯片结果显示miR-125b在儿童AML中表达明显增高,约为正常的12倍,qRT-PCR结果进一步证实了miR-125b在儿童AML中异常高表达,同时还发现miR-125b在儿童AML部分缓解的患者骨髓细胞中表达下降,在完全缓解患者骨髓细胞中降至正常水平。CCK-8结果显示,针对miR-125b的反义寡核苷酸能有效抑制白血病细胞的增殖,与对照组相比有显著差异(P<0.01)。结论: miR-125b在儿童AML中可能起"癌基因"作用,以miR-125b为靶标的反义寡核苷酸可能为儿童AML治疗提供新的方法。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对胰腺癌细胞基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子表达及细胞增殖与侵袭的影响

目的 通过研究结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对人胰腺癌细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)表达及细胞增殖与侵袭力的影响,深入探讨CTGF在胰腺癌发生、发展中的作用机制,为CTGF ASODN在胰腺癌基因治疗中的运用奠定理论基础.方法 经脂质体介导将CTGF ASODN转染人胰腺癌细胞株SW1990,荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测转染细胞CTGF、MMP-9与VEGF mRNA与蛋白表达;噻唑盐(MTT)比色法检测转染细胞的增殖活性;采用Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 (1)荧光显微镜及流式细胞仪检测显示CTGF ASODN可成功转染SW1990细胞.(2)反义组、无义组和单加脂质体组细胞CTGF mRNA表达量分别为0.24±0.09、0.67±0.21、0.63±0.18,反义组较其他组的mRNA表达明显减少(P<0.01);相应的CTGF蛋白表达量分别为0.19±0.07、0.75±0.26、0.71±0.23;相应的MMP-9 mRNA表达量分别为0.21±0.12、0.78±0.35、0.81±0.37;相应的VEGF mRNA表达量分别为0.16±0.06、0.42±0.22、0.43±0.28;相应的MMP-9蛋白表达量分别为0.68±0.22、1.97±0.46、1.92±0.39;相应的VEGF蛋白表达量分别为0.27±0.07、0.52±0.19、0.55±0.18,反义组CTGF、MMP-9和VEGF的表达较其他组显著降低(P<0.01).(3)反义组、无义组、单加脂质体组细胞增殖活性分别为1.67±0.14、2.34±0.17、2.29±0.21,反义组较其他组细胞增殖被显著抑制(P<0.01).(4)反义组、无义组、单加脂质体组微孔滤膜外侧细胞数分别为24.88±6.17、52.37±8.62、55.49±8.83,反义组较其他组微孔滤膜外侧细胞数显著减少(P<0.01).结论 CTGF ASODN转染可有效抑制SW1990细胞CTGF的表达,并降低其MMP-9、VEGF的表达及细胞增殖活性与细胞侵袭力.     

内皮素-1在脂多糖致大鼠门脉高压症中作用的体外研究

目的：研究内皮素-1（ET-1）在脂多糖致门脉高压中的作用及其机制。 方法: 分离、纯化大鼠星状细胞，培养在胶原凝胶上，应用ET-1-ASON和LPS序贯共培养（实验组），以正义、错义ASON作为对照，检测凝胶收缩情况；应用放射免疫法检查培养上清液的ET-1浓度；免疫印迹法检测各组细胞α-actin表达情况；RT-PCR检测各组细胞ET-1表达情况。 结果: 实验组的孔胶原直径缩小至93.3%±3.8％，胶原直径较对照组大(P<0.05)；实验组HSC培养基上清液ET-1为(49.8±7.4)ng/L，显著低于对照组(P<0.01)；实验组HSC表达β-actin较对照组弱；实验组HSC表达ET-1 mRNA显著低于对照组(P<0.01)。 结论: ET-1在脂多糖致门脉高压中通过抑制星状细胞活化而起重要作用，ET-1-ASON在控制脂多糖致门脉高压中具有应用前景。     

核因子κB p65反义寡核苷酸对大鼠肝星状细胞增殖和I型胶原表达的影响

目的 探讨核因子κB(NF-κB)p65反义寡核苷酸(ASOND)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖和I型胶原表达的影响.方法 Ⅳ型胶原酶消化密度梯度离心法分离培养大鼠HSC;脂质体介导的不同浓度的NF-κB p65 ASOND(0.001、0.01、0.1和1μmol/L)进入HSC;台盼蓝染色排斥法检测NF-κBp65 ASOND对HSC的毒性实验并检测各组乳酸脱氢酶(LDH)活性;MTT法测定NF-κB p65 ASOND对1mg/LTNF-α刺激后HSC增殖影响;RT-PCR法和ELISA法检测不同浓度NF-κB p65 ASOND对1mg/LTNF-α刺激后HSC I型胶原表达的影响.结果 转染NF-κB p65 ASODN后,HSC细胞NF-κB蛋白的表达下降,不同浓度(0.001、0.01、0.1和1 μmol/L)的NF-κB p65 ASOND对于体外培养HSC的存活率和LDH无明显影响(P>0.05),0.01～μmol/L的NF-κB p65 ASOND抑制HSC的增殖,lmg/L TNF-α刺激HSC的I型胶原蛋白和mRNA的表达,且随浓度的增加作用增强(P<0.05).结论 NF-κB p65 ASOND可通过抑制NF-κB活性减少HSC活化增殖及Ⅰ型胶原生成,从而减少细胞外基质的产生.     

bcr-ahl融合基因反义寡核苷酸对K562细胞生长的影响

目的：研究 ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因硫代磷酸反义寡核苷酸（Ａｓｐｏ）对 Ｋ５６２细胞生长特性的影响,探讨其在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）基因治疗中的意义。方法：倒置显微镜下细胞活体观察;Ａｓｐｏ与细胞共同培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ及 １２０ｈ,用０．４％台盼蓝染色计各处理组死活细胞数,甲基纤维素半固体培养法观察其克隆形成率的变化,流式细胞仪测定各处理组细胞Ｐ２１０蛋白表达变化。结果：Ａｓｐｏ处理后细胞仍呈克隆状生长,当 Ａｓｐｏ浓度达５μｍｏｌ／Ｌ时,即可产生增殖抑制作用,呈一定的量效关系,其最大抑制效应时间为作用１２０ｈ,当Ａｓｐｏ达１０μｍｏｌ／Ｌ时,在一定细胞浓度范围内（１×１０４／ｍＬ－ ５× １０５／ｍＬ）,均有显著抑制作用,当Ａｓｐｏ浓度达５μｍｏｌ／Ｌ以上时,Ｋ５６２细胞 Ｐ２１０蛋白表达明显下降甚至不表达。 ｂ２ａ２型 Ａｓｐｏ对表达 ｂ３ａ２型 ｍＲＮＡ的 Ｋ５６２细胞也表现出交叉抑制作用。结论：ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因反义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞具有特异性增殖抑制作用,在慢性粒细胞白血病基因治疗中值得深人研究。     

Bcl-2基因反义核酸增强三氧化二砷对NB4细胞凋亡效应

目的:研究和探索bcl-2基因反义核酸(bcl-2ASODN)是否能提高三氧化二砷(As₂O₃)对NB4白血病细胞的凋亡效应。方法:采用微量细胞培养的方法,观察反义核酸、砷剂单独以及反义核酸、砷剂联合培养NB4细胞的生物效应和凋亡形态变化;用免疫组化的方法,结合流式细胞技术,测定NB4细胞的DNA和Bcl-2蛋白的变化。结果:As₂O₃(0.25μmol/L)+bcl-2ASODN(10.0μmol/L)联合诱导NB4细胞凋亡作用显著强于单用As₂O₃(0.25μmol/L)或bcl-2ASODN(10.0μmol/L)(P＜0.01)。流式细胞仪检测显示,联合用药Bcl-2蛋白表达亦明显少于反义核酸、砷剂单独给药组(P＜0.01)。结论:bcl-2基因反义核酸能明显提高和显著增强As₂O₃对NB4白血病细胞的致凋亡效应。     

甲基化寡核苷酸抑制 MRP2表达逆转人肝癌细胞 HepG2多药耐药的研究

背景与目的：多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein2,MRP2)在肝癌细胞过表达,是肝癌细胞多药耐药的主要原因之一。胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸中胞嘧啶甲基化可使基因静止不转录。本研究探讨人MRP2基因甲基化寡核苷酸(methylated oligonucleotide,MON)抑制MRP2基因转录,增加肝癌细胞对化疗药物敏感性的作用。方法：设计了与MRP2启动子区域互补的甲基化寡核苷酸(MON),实验设对照组、MON组、非甲基化寡核苷酸(nonmethylated oligonucleotide,NON)组,MON及NON转染肝癌细胞系HepG2,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析转染后肝癌细胞对化疗药物敏感性的改变;逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)、流式细胞术检测甲基化寡核苷酸对多药耐药相关蛋白MRP2基因转录、蛋白质表达的影响。结果：与对照组相比,MON可以显著抑制MRP2基因转录,下调HepG2细胞MRP2mRNA表达量,抑制MRP2蛋白质的表达,其作用有明显的剂量依赖性,1、2、4、8、16μmol／L MON转染后,MRP2蛋白阳性率分别为18．0％、9．15％、5．73％、3．73％、2．56％,而相同序列的非甲基化寡核苷酸则无此作用。化疗药物对甲基化寡核苷酸转染后HepG2细胞的IC50显著降低。结论：MRP2甲基化寡核苷酸可以抑制肝癌细胞表面MRP2的表达,增加细胞内化疗药物的浓度,逆转肝癌细胞多药耐药。     

肿瘤细胞固有Toll样受体9信号通路的研究进展

Toll样受体（TLR）9与其配体非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的DNA（CpGDNA）特异结合后启动下游信号级联,TLR9信号活化受颗粒体蛋白、可溶性核酸感应蛋白（HMGBl）和可溶性TLR9调控。TLR9不再局限表达于免疫细胞,还在多系统肿瘤细胞中表达,并参与维系与促进肿瘤细胞的恶性生物学行为。肿瘤细胞固有TLR9信号通路功能的阐明将为肿瘤控制提供新思路。     

小鼠双微体扩增基因反义探针用于荷人前列腺癌裸鼠的显像研究

目的探讨^99Tc^m标记针对小鼠双微体扩增基因（MDM2）mRNA的ASON（MDM2反义探针）用于前列腺癌无创性基因显像的价值。方法以HYNIC为螯合物,对含MDM2mRNA某段序列的ASON、错义寡核苷酸（ASONM）进行^99Tc^m标记,检测标记率及放化纯。建立荷人前列腺癌LNCaP裸鼠肿瘤模型,分为3组（每组10只）,进行^99Tc^m-HYNIC—ASON和^99Tc^mHYNIC—ASONM、^99Tc^mO4^-（对照）肿瘤显像。测量肿瘤／对侧肢体（T／M）比值,采用单因素方差分析对测量数据进行统计学分析。结果ASON的^99Tc^m标记率为（65．15±2．05）％,ASONM的^99Tc^m标记率为（64．93±2．18）％。^99Tc^m-HYNIC—ASON和^99Tc^m-HYNIC—ASONM经纯化后,放化纯均达90％以上。不同探针注射后1、4和10h时,^99Tc^m-HYNIC—ASON组T／M比值分别为3．217±0．125、3．749±0．201和4．028~0．186;^99Tc^m HYNIC—ASONM组分别为1．579±0．128、1．715±1．140和1．683±0．139;对照组分别为2．146±0．132、1．847±0．124和1．528±0．152.^99Tc^m-HYNIC—ASON1、4、10hT／M比值与对照组和错义组差异均有统计学意义（F=213．37～235．41,t=3．527～4．738,均P〈0．01）,而^99Tc^m-HYNIC—ASONM组各T／M比值与对照组差异均无统计学意义（t=2．154、2．287和2．236,均P〉0．05）。结论^99Tc^m标记的MDM2反义探针可在荷人前列腺癌裸鼠模型的肿瘤组织中特异性聚集,可以在早期对前列腺癌进行无创性的基因诊断。     

端粒同源寡核苷酸防治光源性皮肤肿瘤的实验研究进展

研究发现,端粒降解是引发DNA损伤反应的起始事件,这一起始事件的实质可能是原本隐藏的端粒单链3'端悬突结构遭到暴露.而外源性端粒同源寡核苷酸能在无紫外线诱导的DNA损伤发生的情况下模拟这个端粒降解信号,并提高机体DNA损伤修复的能力以抵抗紫外线辐射造成的损伤.端粒同源寡核苷酸引发SOS反应并导致恶性转化细胞发生选择性凋亡的特点为光源性皮肤肿瘤的防治提供一种新方法.