核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

反义miR-30a-5p抑制脑胶质瘤生长的体内实验研究

ObjectiveTo study the inhibitory effect of knocking down miR-30a-5p on the U87 human glioma xenograft growth and its possible mechanism. MethodsNude mice bearing subcutaneous U87 human glioblastoma were established and treated with miR-30a-5p antisense oligonucleotides (AS-miR-30a-5p) subcutaneous injection. Tumor size was measured every other day until the observation period ended. Researchers executed the animals after the treatment, stripped tumor tissues and extracted RNA and protein. Real-time PCR were conducted to detect the expression of miR-30a-5p. The histopathological characteristics and proliferation and apoptosis biological characters (including SEPT7, PCNA, cyclinD1, MMP-2, apoptosis related factor P53, bcl-2 and caspase3)were evaluated by HE and immunohistochemical staining, Western blot analysis respectively, and the cell apoptosis was detected by TUNEL method.ResultsIn AS-miR-30a-5p treated group, the tumor growth was delayed and the final tumor volume was smaller than that in the control and scr-ODN treated group (F=7.167, P＜0.05), and the expression of miR-30a-5p was knocked down. The expression of PCNA、cyclinD1 were significantly down-regulated while P53、SEPT7 and caspase3 up-regulated. Apoptotic index was increased significantly. ConclusionAs-miR-30a-5p suppresses the growth of U87 human gliomas xenografts significantly. Malignant phenotype of tumors are reversed to a considerable degree. Therefore, miR-30a-5p can be a candidate for targeted therapy of human glioma.     

反义寡核苷酸对转化生长因子β2刺激的人眼球筋膜囊成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)在滤过泡瘢痕化形成中的作用.方法 对照实验研究.应用二甲基四氮唑盐(M1Tr)法检测脂质体对人眼球筋膜囊成纤维细胞(HTF)活性的影响;用脂质体包裹CTGF的反义寡核苷酸(ASODN)处理经转化生长因子β2(TGF-β2)刺激的HTF,然后用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫细胞化学法检测纤维连接蛋白(Fn)的合成,用RT-PCR和免疫印迹法检测CTGF的表达.结果 3个不同浓度组的脂质体作用HTF后,其吸光度(A)值分别为0.178±0.069、0.196±0.071、0.141±0.036,与正常对照组(0.202±0.073)比较,差异无统计学意义(F=1.65,P＞0.05);单纯的TGF-β2刺激组(T组)与加入了脂质体的TGF-β2刺激组(D组)分别从基因和蛋白水平比较CTGF和Fn的表达,差异无统计学意义(t=0.90,2.32,0.75,2.11;P＞0.05);转染12 h后CTGF与Fn的Mrna水平比较,脂质体介导的CTGF反义寡核苷酸治疗组(A组)的相对灰度RI值明显高于脂质体介导的CTGF正义寡核苷酸对照组(S组)和D组(F=15.25,19.73;P＜0.05);CTGF与FN的蛋白表达水平与Mrna表达水平相一致.结论 CTGF的ASODN能够抑制TGF-β2对HTF表达CTGF和Fn的刺激作用.     

bcl-2反义寡核苷酸对小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响

目的 研究bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响.方法 将NCI-H69细胞培养传代,然后将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,通过脂质体将不同寡核苷酸导入细胞中,用Western-Blot法检测Bcl-2蛋白的表达. 采用直线加速器分别以不同剂量(0、2、4、6、8、10 Gy)X线照射4组细胞.收集照射后的细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数.结果 Western-Blot杂交显示反义寡核苷酸组无Bcl-2蛋白表达,相对正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组及空白对照组Bcl-2蛋白表达明显受到抑制(F=7.24～15.31,q=5.03～7.80,P＜0.01).细胞经X线照射后,反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于空白对照组,差异具有显著性(F=7.24～15.31,q=5.03～7.80,P＜0.01);正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比无统计学差异.4组细胞接受辐射后,反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组,差异有统计学意义(F=11.04～45.56,q=5.10～14.75,P＜0.01),而正义寡核苷酸和无义寡核苷酸组与空白对照组比较则无统计学差异.结论 bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭bcl-2基因的表达,增强小细胞肺癌细胞NCI-H69对X线的敏感性.     

热休克蛋白70 反义寡核苷酸对膀胱癌细胞系EJ细胞对丝裂霉素C敏感性的影响

目的　了解热休克蛋白 70 (HSP70 )反义寡核苷酸增强膀胱癌细胞系EJ细胞对丝裂霉素C (MMC)敏感性的作用。方法　用 10 μmol/LHSP70反义寡核苷酸封闭EJ细胞HSP70mRNA ,将 5 0μg/L的MMC与其共培养 ,采用逆转录 聚合酶链反应技术检测HSP70mRNA表达的降低情况 ,四甲基噻唑蓝试验和集落形成试验检测EJ细胞的生长情况。以正义寡核苷酸、无义寡核苷酸处理及未处理EJ细胞为对照。结果　经HSP70反义寡核苷酸处理的EJ细胞 ,HSP70mRNA的表达 (吸光度值为 132± 18)明显低于经正义、无义寡核苷酸处理的细胞 (吸光度值分别为 312± 2 3、32 5± 12 4 ,U值分别为95、10 1,均P <0 0 1) ;对MMC的敏感性 ,细胞生长抑制率、细胞集落抑制率分别为 (5 4 3± 12 3) %和(5 1 8± 12 6 ) % ,明显高于相应的正义 [(11 2± 3 6 ) %和 (13 4± 4 6 ) % ,U值分别为 86、98,均P <0 0 1]、反义寡核苷酸处理的细胞 [(9 6± 2 3) %和 (10 4± 3 0 ) % ,U值分别为 110、10 6 ,均P >0 0 1]。结论　HSP70反义寡核苷酸能增强膀胱癌细胞系EJ细胞对MMC的敏感性。     

RelA反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株COC1凋亡的影响

目的　探讨RelA反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株COC1凋亡的影响。方法　应用不同浓度的肿瘤坏死因子 (TNF)α或泰素结合RelA反义寡核苷酸 ,分别处理COC1细胞株 ;应用间接免疫荧光、Westernblot、流式细胞术、DNA凝胶电泳等方法 ,检测RelA活化及COC1细胞凋亡。结果　 5 0nmol/L的泰素单独及其与RelA反义寡核苷酸联合处理COC1细胞 12h后 ,COC1细胞的凋亡率分别为 (12 3± 0 6 ) %、(2 7 4± 0 5 ) % ,两者比较 ,差异有极显著性 (P <0 0 1) ;2 4h后 ,COC1细胞凋亡率分别为 (13 0± 0 5 ) %、(31 7± 0 3) % ,两者比较 ,差异有极显著性 (P <0 0 1)。 5 0 μg/L的TNFα单独及其与RelA反义寡核苷酸联合处理COC1细胞 12h后 ,COC1细胞凋亡率分别为 (13 2± 0 4 3) %、(30 8± 0 3) % ,两者比较 ,差异有极显著性 (P <0 0 1) ;同样 10 0 μg/L及 2 5 0 μg/LTNFα单独及其与RelA反义寡核苷酸联合处理COC1细胞的凋亡率相比 ,差异均有极显著性 (P <0 0 1)。结论　RelA反义寡核苷酸可增加TNFα或泰素诱导卵巢癌细胞凋亡的敏感性。     

Antisense oligonucleotides: a systematic high-throughput approach to target validation and gene function determination

Antisense technology provides a high-throughput and systematic approach to drug target validation and gene function discovery. In combination with other emerging technologies (such as microarrays), this technology will enable efficient evaluation of the sequence data generated by the Human Genome Project. The authors review recent advances in the antisense field and discuss the potential use of antisense technology for functional genomics.     

增生细胞核抗原在视网膜色素上皮细胞表达及其反义寡核苷酸的抑制作用

目的 研究视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及其反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS ODN)对其表达和细胞增生的抑制作用，为增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)治疗探索基因治疗新途径。 方法 (1)体外培养兔眼RPE细胞，在不同时间采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(streptoavidin-biotin enzyme complex,SABC)免疫组织化学法检测PCNA的表达;(2)脂质体介导下不同浓度的PCNA AS-ODN和正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,S-ODN)分别作用于体外培养的RPE细胞，采用免疫组织化学方法检测PCNA的表达;(3)四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测在不同浓度的PCNA AS-ODN和S-ODN作用下RPE细胞生长活性及其生长抑制率。 结果 (1)体外培养兔眼RPE细胞表达PCNA，表达高峰为培养后48 h ;(2)在0.28、1.12 μmol/L AS-ODN 作用下，PCNA的表达明显受抑制;(3)0.28、1.12 μmol/L的PCNA AS-ODN 能明显抑制RPE细胞增生活性，并呈剂量依赖性，其生长抑制率分别达53%、81%。 结论 一定浓度PCNA AS-ODN能序列特异性地抑制RPE细胞PCNA表达和增生活性，有望进一步用于PVR的治疗实验研究。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 231-233)     

内皮缩血管肽反义寡核苷酸促进骨髓移植小鼠造血重建

目的观察内皮缩血管肽(Endostatin)反义寡核苷酸转染骨髓基质细胞后在骨髓移植(BMT)小鼠骨髓造血恢复过程中的作用。方法以脂质体作为转染载体,转染不同剂量的 FITC 标记的 Endostatin 反义寡核苷酸,荧光倒置显微镜观察转染效率,用流式细胞术检测最佳转染条件下转染率,用 RT-PCR 和 Western blot 方法检测最佳转染条件下 Endostatin 反义寡核苷酸对 BMT 后不同时间点小鼠骨髓基质细胞 Endostatin mRNA 及其蛋白质和血管细胞间黏附分子1(VCAM-1)mRNA 及其蛋白表达水平的影响。实验分为4组:①正常组:未经任何处理组;②BMT 组:空白对照组;③BMT+转染Endostatin 反义寡核苷酸组;④BMT+转染 Endostatin 错义寡核苷酸组。结果①在体外成功地将 En-dostatin 反义寡核苷酸导入骨髓基质细胞,转染率达86%;②以 Endostatin 反义寡核苷酸转染骨髓基质细胞后,BMT 后不同时间点骨髓基质细胞 Endostatin mRNA 及其蛋白表达被显著抑制[Endostatin 的灰度值分别为(0.09±0.03)～(1.44±1.19)和(0.02±0.02)～(0.14±0.05)](P<0.01或P<0.05),表明转染成功;③Endostatin 反义寡核苷酸转染有效促进了 BMT 后不同时间骨髓基质细胞 VCAM-1mRNA 及其蛋白表达[VCAM-1的灰度值分别为(1.60±0.92)～(8.05±0.87)和(0.07±0.02)～(0.67±0.09)](P<0.01或P<0.05);④Endostatin 错义寡核苷酸对 BMT 后不同时间骨髓基质细胞 Endostatin 和 VCAM-1的表达基本无影响(P>0.05)。结论 Endostatin 反义寡核苷酸可降低Endostatin 表达,增强 VCAM-1的表达,从而促进骨髓微血管生成,改善基质细胞与造血细胞之间和细胞外基质与造血细胞之间的联系而影响骨髓造血。     

端粒酶活性与膀胱癌T24细胞生长

目的 :研究端粒酶逆转录酶基因 (h TERT)反义寡核苷酸 (ASODN)对膀胱癌 T2 4细胞生长的影响。方法 :用脂质体介导技术 ,将 h TERT基因 ASODN转染入膀胱癌 T2 4细胞中应用端粒酶 PCR- EL ISA法检测端粒酶活性变化 ,MTT法测定细胞生长变化 ,并用流式细胞术观察其对 T2 4细胞周期的影响。结果 :h TERT基因 ASODN能显著地抑膀胱癌 T2 4细胞端粒酶活性 ,癌细胞生长增殖受限 ,同时抑制具有序列特异性和剂量依赖性 ,并出现细胞凋亡现象 ,其凋亡率 (15 .8% )明显高于 SODN转染组 (0 )和空白对照组 (1.9% ,P<0 .0 5 )。结论 :h TERT基因 ASODN能特异性抑制膀胱癌 T2 4细胞端粒酶活性和生长 ,促进其细胞凋亡。