脂肪分化相关蛋白反义寡核苷酸降低乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶活性

目的：已经发现随着细胞内胆固醇酯的积聚，脂肪分化相关蛋白的表达明显增加。本文进一步探讨脂肪分化相关蛋白干预细胞内胆固醇代谢的作用位点。 方法： Ox-LDL组为80 mg/L 氧化低密度脂蛋白与C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育，Ox-LDL+antisense组另加1 mmol/L脂肪分化相关蛋白反义寡核苷酸，在不同的时点取样，共观察4 d。使用荧光分光光度计观察细胞内胆固醇酯的改变；使用脂肪分化相关蛋白抗体间标法结合流式细胞术，观察脂肪分化相关蛋白表达量的变化；使用Ox-r［CL-3H］LDL和液体闪烁计数器观察细胞对氧化低密度脂蛋白摄入量的变化，并同时测定乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶的活性。 结果： 72 h后，Ox-LDL+antisense组细胞内胆固醇酯（19.9±1.9）mg/g protein显著低于Ox-LDL组（46.6±3.4）mg/g protein。4 d观察期间，脂肪分化相关蛋白蛋白的表达量两组细胞都增加，从12 h时点开始，Ox-LDL组大于Ox-LDL+antisense组，在4 d时点，Ox-LDL组明显高于Ox-LDL+antisense组。两组细胞摄入Ox-r［CL-3H］LDL的量逐渐增加，但是，Ox-LDL+antisense组摄入量从1 d后明显低于Ox-LDL组，在2 d和4 d时点，两组差别仍有显著性。乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶相对活性从6 h到2 d表现为增加，在2 d时点，两组比较差别显著，Ox-LDL+antisense组的活性明显低于Ox-LDL组。但从2 d到4 d，乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶相对活性稳定。ACAT的活性与脂肪分化相关蛋白蛋白的表达量相关分析表明，Ox-LDL组R2＝0.6176 （P＜0.05），Ox-LDL+antisense组R2＝0.8212（P＜0.05）。 结论： 抑制脂肪分化相关蛋白表达能引起细胞摄入外源性脂蛋白减少和乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶的活性降低，提示脂肪分化相关蛋白与脂滴的代谢功能密切相关，且乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶有可能是其潜在的位点。     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响。方法:将LMP1基因真核表达质粒转染至鼻咽癌CNE1细胞,脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测LMP1和P53蛋白表达,原位杂交技术检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达。 结果:对照组,转染并表达LMP1基因的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞。端粒酶反义核酸作用组,LMP1基因转染细胞的LMP1蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.01);LMP1基因转染细胞与未转染细胞和转染空载质粒的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著低于对照组(P＜0.01),但LMP1基因转染细胞的增殖能力和P53蛋白表达水平仍显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞(P＜0.01)。 结论:EB病毒LMP1可促进鼻咽癌细胞P53蛋白的表达。     

hTERT反义寡核苷酸促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡

目的：探讨转染人端粒酶逆转录酶基因（hTERT)反义寡核苷酸后能否增强紫杉醇诱导皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78凋亡。方法:采用脂质体介导的基因转染技术将hTERT反义寡核苷酸（AODN)、正义寡核苷酸（SODN)导入Hut78细胞株中，应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法（TRAP-PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应、四甲基偶氮唑蓝法（MTT)、台盼蓝拒染法和流式细胞仪分析测定联合应用紫杉醇后对细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、细胞增殖及凋亡的影响。结果:转染hTERT基因反义寡核苷酸并联合应用紫杉醇，48 h后Hut78细胞增殖即被明显抑制，端粒酶活性下降，hTERT mRNA表达降低，分别同SODN联合紫杉醇组及单用紫杉醇组进行比较，有显著差异（P<0.05)； MTT结果显示，紫杉醇对AODN组、SODN组及空白对照组细胞的IC50值分别为(81.10 ± 1.68) nmol/L，(138.70±1.80) nmol/L和(139.40± 5.50) nmol/L，差异显著（P< 0.05)；经流式细胞仪检测，AODN联合紫杉醇组凋亡率明显高于SODN联合紫杉醇组和单用紫杉醇组。结论:hTERT反义寡核苷酸与紫杉醇有协同抗肿瘤效应，并能增加Hut78细胞对紫杉醇的敏感性，促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的诱导效应

目的：利用骨肉瘤OS-732细胞，探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对survivin基因表达的影响及其诱导肿瘤细胞凋亡的效应。 方法: 设计合成特异性靶向survivin的ASODN，以不同浓度和时间对OS-732细胞进行转染，并设空白、正义（SODN）对照组进行比较。采用RT-PCR、Western blotting、免疫细胞化学技术检测各组OS-732细胞中survivin mRNA、蛋白表达状态，吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色法、流式细胞仪检测细胞凋亡水平和形态变化，MTT法检测细胞生长抑制情况，激酶活性测定法检测细胞中caspase-3活性程度。 结果: 转染ASODN各组OS-732细胞survivin mRNA和蛋白表达均明显弱于空白对照组、SODN组；细胞凋亡率（AI）显著增加，细胞生长相应受抑，caspase-3活性显著提高；上述效应在ASODN各组存在一定的时间浓度依赖性；而SODN各组与空白对照组间各项指标均无明显差异。 结论: ASODN能够特异性下调OS-732细胞中survivin基因表达，激活凋亡效应蛋白酶caspase-3，在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖中发挥重要作用。     

hTERT 基因反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的研究

目的 在体外实验中，探讨hTERT反义核酸诱导卵巢癌细胞发生凋亡的可能性，揭示该凋亡发生与bcl-2和bax之间的关系。方法采用TUNEL染色法，定性、定量地研究hTERT反义核酸与卵巢癌细胞凋亡的关系；通过免疫组织化学法检测凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果hTERT反义核酸在体外能诱导卵巢癌细胞发生凋亡。下调bcl-2的表达，增强bax的表达。结论诱导卵巢癌细胞发生凋亡是hTERT反义核酸抗卵巢癌作用的机制之一。hTERT反义核酸可能通过下调bcl-2的表达及增强bax的表达诱导卵巢癌细胞发生凋亡。     

hTERT表达水平对乳腺癌干细胞体外生物学行为的影响

目的观察人端粒酶反转录酶反义寡核苷酸(h TERT ASODN)对乳腺癌干细胞生物学行为的影响。方法合成针对人端粒酶反转录酶(h TERT)的反义寡核苷酸,以脂质体转染的方法将其转染入乳腺癌干细胞,设为ASODN组,以正义序列转染作为阴性对照组,并设未处理对照组。RT-PCR和Western blot分别检测各组h TERT基因和蛋白表达。应用CCK8法检测转染对乳腺癌干细胞增殖的影响,Transwell小室法检测干细胞侵袭、迁移能力。结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示,ASODN组h TERT基因相对表达量为0.40±0.03,低于阴性对照组(0.81±0.05)和未处理对照组(0.79±0.04),F=137.33,P<0.001;h TERT基因蛋白相对表达量为0.39±0.06,低于阴性对照组(0.87±0.04)和未处理对照组(0.90±0.02),F=59.29,P<0.001。CCK8结果显示,乳腺癌干细胞培养12、24、36、48和60 h,ASODN组细胞增殖能力明显低于阴性对照组和未处理对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭实验,ASODN组穿越Transwell小室的细胞数为8.40±0.36,低于阴性对照组(15.64±0.13)和未处理对照组(14.31±1.12),F=94.56,P<0.001。Transwell迁移实验,ASODN组穿越Transwell小室的细胞数为30.6±8.03,低于阴性对照组(51.40±5.66)和未处理对照组(53.11±6.34),F=20.11,P=0.002。结论 h TERT ASODN可显著抑制乳腺癌干细胞体外增殖、侵袭和迁移能力。     

C-myc反义核酸对内皮素诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

应用不同浓度的Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸处理体外培养的经１０－８ｍｏｌ／Ｌ内皮素－１（ＥＴ－１）诱导的人肺动脉平滑肌细胞,通过细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入值观察该反义核酸对细胞增殖及ＤＮＡ合成的抑制作用,应用斑点杂交法检测平滑肌细胞Ｃ－ｆｏｓ和Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ的表达水平。结果表明,１０、２０、５０μｇ／ｍｌ反义寡核苷酸对细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入值与对照组相比抑制率分别为１１．９％和１２．３％（Ｐ＜０．０５）,２１．６％和１４．７％（Ｐ＜０．０１）,３６．３％和２７．２％（Ｐ＜０．０１）;对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ表达抑制率分别为７１．３％（Ｐ＜０．０５）,８０．７％（Ｐ＜０．０５）,９２．５％（Ｐ＜０．０１）;５０μｇ／ｍｌ反义核酸对Ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ表达抑制率是７９．７％,１０、２０μｇ／ｍｌ组无抑制作用。Ｃ－ｍｙｃ反义核酸能显著抑制内皮素诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖,其作用系依赖反义核酸的序列特异性和剂量依赖。     

bFGF反义寡核苷酸对大鼠肺成纤维细胞增殖信号通路的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸(AODN)对大鼠肺成纤维细胞增殖、转化信号通路的影响。方法:分离成年大鼠肺成纤维细胞,分为4组:对照组(未转染肺成纤维细胞);TGF-β1组(未转染肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+AODN组(转染AODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+RODN(正义寡核苷酸)组(转染RODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激)。每组设3复孔,并作细胞爬片,镜下计数肺成纤维细胞数量,绘制生长曲线。MTT比色法测定肺成纤维细胞增殖率。免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。通过ELISA法检测培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量。用RT-PCR法分析肺成纤维细胞Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、Ⅰ型胶原mRNA表达水平。结果:1细胞计数显示:TGF-β1+RODN组各时段成纤维细胞的数目均较对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组明显增多(P<0.05);TGF-β1+AODN组中成纤维细胞增殖数比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。2MTT结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞光密度值明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞光密度值明显比TGF-β1组减低(P<0.05)。3免疫细胞化学染色结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞与对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组比较,α-SMA染色的平均光密度值(IOD)明显增加(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞α-SMA染色的平均光密度值(IOD)比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。4 ELISA法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。5RT-PCR法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显比TGF-β1组明显减低(P<0.05);TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad7mRNA表达明显低于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad7 mRNA表达比TGF-β1组明显增加(P<0.05)。结论:bFGF反义寡核苷酸可抑制肺成纤维细胞的增殖、转化及胶原合成,bFGF反义寡核苷酸可能通过下调TGF-β1-Smad信号通路来发挥作用。     

鞘内注射PSD-93反义寡核苷酸对大鼠神经病理性痛的疗效

目的 探讨鞘内注射PSD-93反义寡核苷酸对大鼠神经病理性痛的疗效.方法 雄性SD大鼠60只,随机分为5组(n=12):假手术组(S组)、C7脊神经压迫组(N组)、C7脊神经压迫+鞘内注射PSD-93误义寡核苷酸10 μg组(M组)、C7脊神经压迫+鞘内注射PSD-93反义寡核苷酸5 μg组(AJ组)和C7脊神经压迫+鞘内注射PSD-93反义寡核苷酸10 μg组(A2 组).N组、M组、A1组和A2组用60 g无创微血管夹压迫大鼠右侧C7脊神经15 min,制备神经病理性痛模型,经枕骨大孔鞘内置管,术毕当日开始给药,每日1次,连续4 d.于术前2 d(T0)和术后1、3、5、7 d(T1-4)测定机械痛阈和、热痛阈;T2和T4时分别处死6只大鼠,取C7脊髓,免疫组化法测定脊髓背角PSD-93蛋白表达.结果 与S组比较,N组、M组和A1组T1-4时机械痛阈及热痛阈降低,N组和M组T2,4时脊髓背角PSD-93蛋白表达上调(P＜0.05);与N组和M组比较,A1组T1,2时、A2组T1～4时机械痛阈及热痛阈升高,A1组T2时、A2组T2,4时脊髓背角PSD-93蛋白表达下调(P＜0.05);与A1组比较,A2组T1-4时机械痛阈及热痛阈升高,T2,4时脊髓背角PSD-93蛋白表达下调(P＜0.05).结论 鞘内注射PSD-93反义寡核苷酸可减轻大鼠神经病理性痛.     

脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸体外转染率及对人膀胱癌EJ细胞的影响

目的通过以脂质体为载体介导端粒酶反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,asODN)转染人膀胱癌EJ细胞,促进反义寡核苷酸对膀胱癌EJ细胞的生长抑制。方法利用脂质体为载体将针对端粒酶RNA模板区的asODN转染膀胱癌EJ细胞;荧光显微镜观察细胞转染率;PCR-ELISA法测定端粒酶活性;MTT法检测反义寡核苷酸对膀胱癌细胞的抑制。结果脂质体介导的asODN在膀胱癌EJ细胞中的转染率1/2h、4h、8h分别为15%、56%、80%,并且细胞的端粒酶活性和细胞生长明显被抑制,与对照组比较,具有显著性差异(p(0.05)。结论脂质体介导的端粒酶asODN能够有效抑制膀胱癌EJ细胞端粒酶活性和生长,可应用于实验性肿瘤基因治疗研究和端粒酶与膀胱癌关系的进一步研究。