RT-PCR中加工过的假基因的干扰及解决办法

目的发现和克服ＲＴ－ＰＣＲ中可能存在的假基因的干扰。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增人肺鳞癌标本中角蛋白１９（ＣＫ１９ｃＤＮＡ或ＤＮＡ序列。结果通过设立分别以基因组ＤＮＡ和未经逆转录的ＲＮＡ为模板的对照可观察到ＣＫ１９假基因的干扰现象。用脱氧核糖核酸酶预处理ＲＮＡ标本或在设计错配引物的基础上选择合适的退火温度可消除干扰。结论在运用ＲＴ－ＰＣＲ法分析哺乳动物基因表达时常存在假基因的干扰，以上方法可有效地发现和克服这种干扰作用     

从噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白单链抗体

目的　从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白单链抗体 (scFv)并进行鉴定。方法　以人表皮角蛋白为抗原 ,通过“吸附 洗脱 扩增”过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白单链抗体 ,对其抗原结合活性、识别角蛋白的相对分子质量 (Mr)和序列进行分析鉴定。结果　经过筛选 ,获得 6株能与角蛋白特异性结合的阳性克隆 ,所识别角蛋白的Mr 相同 ,均在 5 6 0 0 0～ 5 70 0 0之间 ;序列分析显示 ,所获抗体克隆的可变区基因分别属于免疫球蛋白基因家族的不同亚群。结论　利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白单链抗体     

Epidermal participation in post-burn hypertrophic scar development

 The reconstruction of epidermal architecture over time in normotrophic and hypertrophic scars in untransplanted, spontaneously healed partial-thickness burns has scarcely been studied, unlike the regeneration of epidermal grafts used to cover burn wounds and the regeneration of the dermis during hypertrophic scarring. The expression of markers of epidermal proliferation, differentiation and activation in normotrophic and hypertrophic scars in spontaneously healed partial-thickness burns was assessed and compared with the expression of these markers in normal control skin of healthy persons to determine whether hypertrophic scarring is associated with abnormalities in the phenotype of keratinocytes. Punch biopsies were taken both of partial-thickness burns after re-epithelialisation and of matched unburned skin. At 4 and 7 months post-burn, biopsies were taken of normotrophic and hypertrophic scars that had developed in these wounds. The biopsies were analysed using immunostaining for markers of keratinocyte proliferation, differentiation and activation (keratins 5, 10, 16 and 17, filaggrin, transglutaminase and CD36). We observed a higher expression of markers for proliferation, differentiation and activation in the epidermis of scars at 1 month post-burn than in normal control skin of healthy persons. There was a striking difference between normotrophic and hypertrophic scars at 4 months post-burn. Keratinocytes in hypertrophic scars displayed a higher level of proliferation, differentiation and activation than did normotrophic scars. At 7 months post-burn all keratinocyte proliferation and differentiation markers showed normal expression, but the activation marker CD36 remained upregulated in both normotrophic and hypertrophic scars. Surprisingly, in matched unburned skin of burn patients, a state of hyperactivation was observed at 1 month. Our results suggest that keratinocytes may be involved in the pathogenesis of hypertrophic scarring. Received: 16 September 1998 / Accepted: 28 September 1998     

乳腺癌患者外周血癌胚抗原及细胞角蛋白19 mRNA表达的临床意义

目的 探讨细胞角蛋白19(CK19)mRNA、癌胚抗原(CEA)mRNA的表达在诊断乳腺癌患者外周血微转移的临床意义及与临床病理指标的关系.方法 采用实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)法,测定28名健康女性志愿者、20例良性乳腺疾病患者、108例乳腺癌患者(88例行手术切除乳腺癌患者、20例复发转移乳腺癌患者)的外周血中CK19、CEA mRNA的表达.以上有一项为阳性即判定为转移.结果 28名健康对照者CK19 mRNA和CEA mRNA两个指标检测结果均为阴性.20例良性乳腺疾病患者中,CK19 mRNA阳性1例(5%),无CEA mRNA表达阳性者.108例乳腺癌患者中,26例(24.1%)CK19 mRNA阳性,23例(21.3%)CEA mRNA阳性,15例(13.9%)两者均阳性.在108例乳腺癌患者中,复发转移乳腺癌患者CK19 mRNA和(或)CEA mRNA的表达高于行手术切除乳腺癌患者.88例行手术切除乳腺癌患者外周血微转移阴性组、阳性组在肿瘤大小、病理分期、kI67,细胞黏附分子CD44变异型v6(CD44v6),血管内皮生长因子(VEGF)表达方面差异有统计学意义(P<0.05),但在年龄、肿瘤位置、病理组织学类型、淋巴结转移、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、CerbB2、基质金属蛋白酶9(MMP9)表达等方面差异无统计学意义(P>0.05).多因素分析表明肿瘤大小、病理分期、kI67、CD44v6、VEGF与患者外周血微转移有关.结论 联合检测CK19mRNA和CEA mRNA可提高乳腺癌患者外周血微转移的检出率.肿瘤大小、病理分期、kI67、CD44v6、VEGF可评估乳腺癌患者外周血微转移风险.     

大肠癌淋巴结微转移基因检测的意义

目的：应用反转录聚合酶链反应（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＲＴ－ＰＣＲ）法检测大肠癌的淋巴结微转移。方法：１７例行根治性手术的大肠癌患者,应用ＲＴ－ＰＣＲ法检测切除的２０５个淋巴结中细胞角蛋白２０（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ２０,ＣＫ２０）ｍＲＮＡ的表达,另取４例良性胃肠道疾病患者的３１个淋巴结作为阴性对照;并采用系列稀释试验检测本法     

人发角蛋白人工肌腱的免疫学研究及临床应用的初步结果

目的　研究人发角蛋白人工肌腱 ( human- hair keratin artificial tendon,HHKAT)的组织相容性、抗原性及其在上肢肌腱修复术或功能重建术中的应用。方法　取 18只 Wistar大白鼠 ,将 HHKAT(实验组 )及相同重量的正常人发 (对照组 ) ,分别埋植至大鼠脊柱两侧皮下。术后 2、8和 12周取材 ,比较两种材料的组织学反应。临床应用 HHKAT14例 ,另选 2 5例为对照组。术前、术后分别取其外周血 ,测定免疫球蛋白 Ig G,Ig A,Ig M,补体 C3 ,T淋巴细胞亚群以及 T淋巴细胞转化 ,并对其结果进行比较。结果　实验结果证实 HHKAT的组织相容性较好 ,对组织的刺激性小于正常人发 ( P<0 .0 5 )。 14例术前、术后的免疫学指标无明显差异 ( P>0 .0 5 ) ,与对照组相比也无明显差异 ( P>0 .0 5 ) ;证实 HHKAT对人体无明显的抗原性。患者切口均一期愈合 ,术后随访 13～ 2 5个月 ,功能与病种及肌力评定 ,患肢功能恢复优良率达 92 .8%。结论　 HHKAT为目前较为理想的一种人工肌腱代用品     

从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体,对其抗原结合活性的序列进行分析鉴定。结果;经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判断所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

红景天苷下调KRT17增加紫杉醇对卵巢癌细胞的化疗敏感性

[目的] 红景天苷是从景天科植物大株红景天的干燥根及根茎或干燥全草中提取的一种化合物,具有多种药理作用。研究旨在探讨红景天苷下调角蛋白家族成员17（KRT17）影响紫杉醇对卵巢癌细胞的化疗敏感性。[方法] 红景天苷、紫杉醇单独或联用处理SKOV-3细胞,将细胞随机分为4组：对照组、红景天苷单独处理组、紫杉醇单独处理组和联合处理组,Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞毒性,5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EDU）检测细胞增殖,Hoechst 33258检测细胞凋亡。免疫荧光法检测自噬体形成情况,蛋白免疫印迹法检测KRT17和细胞自噬相关蛋白表达水平。[结果] 与对照组比较,红景天苷、紫杉醇单独处理组随浓度的升高,对SKOV-3细胞的毒性增强,细胞增殖数、P62蛋白表达降低,细胞凋亡率、LC3荧光斑点数、LC3-Ⅱ/LC3-I比值、Beclin1蛋白表达升高。且红景天苷与紫杉醇协同处理效果优于红景天苷、紫杉醇单独处理组,可能是红景天苷通过下调KRT17蛋白表达实现的。[结论] 红景天苷下调KRT17增加紫杉醇对卵巢癌细胞的化疗敏感性。     

组织多肽抗原联合ProGRP、CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1在肺癌诊治中的价值

目的 评估组织多肽抗原（TPA）联合ProGRP、CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1在肺癌诊断与疗效监测中的应用价值。方法 用化学发光法和电化学发光法检测238例肺癌患者、25例肺部良性疾病患者及65名健康对照者血清中的TPA、ProGRP、NSE、SCC、CYFRA21-1和CEA水平,并对33例肺癌患者进行随访检测。同时用SPSS19.0统计软件及接受器工作性能曲线（ROC）分析,评价肿瘤标志物的临床应用价值。结果 肺癌患者血清TPA水平（中位数为130.45 U/L）明显高于肺部良性疾病患者（中位数为82.21 U/L）和健康对照组（中位数为70.96 U/L）（P=0.000, 0.002）。根据ROC曲线分析,TPA检测肺癌的临界值为130 U/L,敏感度为50%,特异性为88.9%,相比于其他肺癌标志物( ProGRP、NSE、SCC、CYFRA21-1、CEA）,敏感度较高,特异性稍低。肺癌患者血清TPA水平及阳性率随着肿瘤分期的升高而升高（P均<0.05）。TPA水平与疗效也密切相关,临床治疗有效时TPA下降,而病情恶化或出现转移时则升高。各种组合检测中,以六项组合诊断肺癌的敏感度和有效性最高。结论 TPA联合ProGRP、CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1测定在肺癌的诊断、疗效及监测复发转移中,具有一定的临床价值。