脂肪间充质干细胞条件培养基及其外泌体促成骨作用的体外研究

目的研究大鼠脂肪间充质干细胞（ASC）条件培养基及其外泌体的体外促成骨作用。 方法分离培养原代大鼠ASC和骨髓间充质干细胞（BMSC）并进行鉴定;超速离心法收集/去除条件培养基中的外泌体,采用透射电镜法及粒径分析法鉴定所获取的外泌体;细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测其对细胞增殖的影响;Transwell检测其对细胞迁移的影响;碱性磷酸酶（ALP）活性实验和实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测其对成骨的影响。SPSS 20.0软件、Bonferroni检验进行统计学分析。 结果实验所获取的原代BMSC和ASC符合间充质干细胞鉴定标准。透射电镜及粒径分析结果表明所获取的外泌体具有典型的外泌体形态特征。CCK-8实验表明培养7 d后,各处理组中A₄50值存在差异（F= 157.74,P= 0.001）,BMSC增殖条件培养基组A₄₅₀值（2.71 ± 0.15）高于对照组（1.95 ± 0.11）;去外泌体组的A₄₅₀值（2.28 ± 0.34）低于条件培养基组。Transwell实验结果表明,培养24 h后各处理组中的迁移细胞数存在差异（F= 46.79,P= 0.001）,条件培养基组迁移细胞数（51.6 ± 1.3）高于对照组（28.6 ± 1.4）,去外泌体组迁移的细胞数（37.2 ± 2.2）低于条件培养基组。ALP活性实验结果表明,培养7 d后各处理组中的ALP活性存在差异（F= 78.43,P= 0.001）,条件培养基组ALP活性为（310 ± 11）,高于对照组（200 ± 24）,去外泌体组ALP活性为（240 ± 19）低于条件培养基组。实时荧光定量PCR检测成骨相关基因的表达,各处理组中的基因表达存在差异（F_ALP= 32.30,P_ALP= 0.001;F_RUNX2= 26.78,P_RUNX2= 0.001）。 结论成骨诱导后大鼠ASC条件培养基及其中的外泌体能够有效的促进BMSC增殖、迁移和成骨向分化,具有体外促成骨作用。     

胎盘外泌体在子宫螺旋动脉重铸不全相关妊娠并发症中的作用

子宫螺旋动脉重铸是胎盘滋养细胞与母体血管内皮、平滑肌细胞、免疫细胞等相互作用下完成的,细胞间信息传递在这一过程中起重要作用。外泌体的发现更新了学者们对细胞间信息传递的思考模式。外泌体是细胞主动分泌的直径40~100 nm的囊泡,可由多种细胞分泌并可从多种体液中分离出来,携带多种蛋白质、mRNA、微小RNA(miRNA)等信号分子,在细胞间通讯起重要作用。研究证明,胎盘滋养细胞能分泌外泌体,在母血中能检测并分离出胎盘外泌体,胎盘外泌体携带滋养细胞信息,作用于母体细胞,调节血管形成,重铸子宫螺旋动脉,调节母体免疫,参与胎盘屏障的形成。综述胎盘外泌体的特征、生物学功能及其在螺旋动脉重铸不全相关妊娠并发症中的变化,探讨胎盘外泌体作为诊断妊娠并发症血清标志物的临床价值。     

癌相关成纤维细胞来源的外泌体在促骨肉瘤侵袭转移中作用的实验研究

目的 探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)来源的外泌体对骨肉瘤侵袭及转移的影响。方法 利用人源骨肉瘤细胞株Saos-2采用差速贴壁法分离、培养CAFs,显微镜下观察CAFs的形态,免疫组织化学观察α-SMA蛋白表达对CAFs进行鉴定。培养CAFs,采用ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒分离外泌体。通过透射电镜观察外泌体形态,Western blot检测外泌体特异性标记蛋白β-actin、CD63表达情况对外泌体进行鉴定。培养人源骨肉瘤细胞株Saos-2,分为外泌体组和对照组,采用细胞划痕及Transwell小室实验观察外泌体对Saos-2细胞迁移和侵袭能力的影响。选取一级5周龄BALB/c-nu雌性裸鼠12只,按编号随机分为外泌体组和对照组,每组6只。两组均采用皮下移植成瘤法在裸鼠右侧背部皮下接种人骨肉瘤Saos-2细胞与Matrigel基质胶混合悬液,建立裸鼠骨肉瘤肿瘤模型。造模结束后即刻进行尾静脉注射:外泌体组每只裸鼠通过尾静脉注射浓度为0.1 μg/μL的外泌体悬液30 μL,对照组裸鼠尾静脉注射等量生理盐水,两组均1次/周,共注射6次。第1次注射后每日观察裸鼠成瘤情况,从裸鼠右侧背部皮下可触及肿块开始,测量两组裸鼠肿块的最长径和最长径的最大垂直短径,计算肿瘤体积,此后每周测量1次,共测量6次。完成最后一次测量后腹腔麻醉断椎法处死裸鼠,完整取出肿块并称重。取裸鼠肺组织进行切片HE染色观察两组裸鼠肺转移情况。结果 显微镜下观察CAFs呈长梭形,排列杂乱,无方向性;细胞免疫组织化学染色结果显示:CAFs的α-SMA蛋白表达阳性,提示CAFs提取成功。电镜观察外泌体呈70～100 nm圆形或椭圆形膜性囊泡状结构;Western blot结果显示外泌体中CD63蛋白呈高表达,β-actin蛋白表达较弱,提示成功分离CAFs来源外泌体。细胞划痕实验、侵袭实验结果显示:外泌体组细胞迁移距离、迁移率、侵袭细胞数目分别为(0.19±0.02)mm、0.81%±0.11%、(53.67±5.69) 个,均高于对照组的(0.81±0.11)mm、0.32%±0.11%、(31.67±8.08) 个,差异均有统计学意义(t=6.209、6.209、3.856, P值均＜0.01)。外泌体组和对照组12只裸鼠采用皮下移植成瘤法接种人骨肉瘤Saos-2细胞与Matrigel基质胶混合悬液,均造模成功,实验过程中无一例动物死亡。两组裸鼠均于第1次注射肿瘤细胞后1周触及肿块,肿瘤体积均随着时间的延长明显增大,差异均有统计学意义(F=49.428、8.477, P值均＜0.05)。两组间比较,第1、2次测量肿瘤体积,差异均无统计学意义(P值均＞0.05);而第3～6次测量肿瘤体积,外泌体组均大于对照组,差异均有统计学意义(t=4.697、4.825、3.516、2.706, P值均＜0.05)。测量6次后处死裸鼠,剥除肿瘤,外泌体组肿瘤质量(1.62±0.29)g大于对照组(1.00±0.43)g,差异有统计学意义(t=2.929, P＜0.05)。肺组织切片HE染色结果显示,两组裸鼠均发生肺转移,外泌体组肺组织转移灶数量为6.63(3,17)个,多于对照组的1.17(0,3)个,差异有统计学意义(W=36.000, P＜0.01)。结论 CAFs来源的外泌体可增加骨肉瘤细胞株Saos-2的迁移及侵袭能力,同时促进骨肉瘤的生长和肺转移的形成。     

外泌体在结直肠癌中的研究进展

近年来,由于对外泌体的不断认识和了解,研究外泌体已成为当下的热点,外泌体是细胞分泌的一种纳米级囊泡结构,可来源于机体正常细胞及肿瘤细胞,在血液、唾液、尿液、母乳等多种体液中均有分布,其参与许多生物学和病理学过程,主要是由于它们在细胞间通讯作用,源自结直肠癌（CRC）细胞的外泌体与肿瘤发生、进展、转移、预后等相关。本文就外泌体在结直肠癌中的研究进展进行综述。     

液体活检在肺癌精准医疗中的应用

肺癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,同时也是发病率最高、死亡率最高、增长速度最快且预后最差 的恶性肿瘤之一。许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高,男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位,女性发病率占第二位,死亡率占第二位。近十余年来,液体活检由于其具有创伤性小、费用低、敏感性高等优点,逐渐成为了肺癌精准医疗中的研究热点。目前液体活检在肺癌精准医疗中的应用主要包括CTCs、ctDNA和外泌体等的检测。其中,CTCs不仅是肺癌早期诊断的有效手段、对肺癌的分期有一定帮助,还可作为疾病潜在的预后指标;ctDNA不仅可以作为肺癌诊断的可行工具、个性化治疗的参考指标,还可作为肿瘤潜在的生物标志物,帮助预测患者术后的复发;而外泌体被广泛认为是血液中潜在的肿瘤生物标志物,对肺癌的早期诊断、治疗及预后判断极其重要,甚至可以作为肺癌治疗的潜在靶点。本文基于不同的液体活检生物标记物,就CTCs、ctDNA、外泌体的生物学特性及临床应用进行了综述。     

白细胞介素2锚定的exosomes的制备及其对膀胱癌细胞的诱导杀伤效应

目的 制备白细胞介素2(IL-2)锚定的肿瘤细胞来源的exosomes疫苗,探讨其体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗肿瘤效应.方法 构建含糖基化磷脂酰肌醇(GPI)信号肽序列与人IL-2的融合基因的pEGFP-N1-IL2gpi质粒,建立稳定表达GPI-IL-2的T24细胞系(T24/GPI-IL-2).采用超速和蔗糖梯度密度离心法提取Ex/GPI-IL-2(即T24/GPI-IL-2细胞培养液中提取的exosomes),并对其进行形态学观察和分子标志检测.通过混合淋巴细胞实验和细胞毒实验,观察Ex/GPI-IL-2对T细胞的增殖和诱导杀伤效应.结果 成功构建重组质粒pEGFP-N1-IL2gpi,建立了稳定表达GPI-IL-2蛋白的细胞系.Ex/GPI-IL-2为直径约30～90nm的类圆碟形小囊泡,表达细胞间黏附分子1(ICAM-1)、热休克蛋白70(HSP70)、MAGE-1和GPI-IL-2等免疫相关蛋白.Ex/GPI-IL-2经过树突状细胞负载后,能更有效地诱导T细胞的增殖和细胞毒效应(P＜0.05).结论 通过基因转染技术,可以将IL-2锚定到肿瘤细胞来源的exosomes上,获得的Ex/GPI-IL-2能够诱导CTL对肿瘤细胞产生更强的诱导杀伤效应,为以exosomes为基础的肿瘤免疫治疗提供了新的途径.

Abstract：

Objective To prepare IL-2-anchored and tumor-derived exosomes vaccine, and investigate the antitumor efficiency of the special cytotoxic T-lymphocytes induced by Ex/GPI-IL-2.Methods To construct pEGFP-N1-IL2gpi plasmid coding a fusion gene of a DNA oligo encoding GPI-anchor signal sequence attaching to human IL-2 cDNA. Then T24 cell lines stably expressing GPI-IL-2 proteins (T24/GPI-IL-2) were established. Ex/GPI-IL-2 were isolated and purified by ultrafiltration and sucrose gradient centrifugation, and the morphology and molecuule markers were analyzed. The mixed lymphocyte reaction study and cytotoxic study were performed to determine the proliferative effect of T lymphocytes and the cytotoxicity induced by Ex/GPI-IL-2. Results The pEGFP-N1-IL2gpi plasmid was successfully constructed, and cell lines stably expressing GPI-IL-2 fusion proteins were established. Ex/GPI-IL-2 were small vesicular and saucer-shaped in diameter of 30-90 nm, containing heat shock protein 70,intercellular adhesion molecule-1, MAGE-1 and GPI-IL-2. Ex/GPI-IL-2-pulsed could dendritic cells induce proliferation of T cells and cytotoxic immune response more efficiently (P ＜0.05). Conclusions GPI-IL-2 gene-modified tumor cells can make the exosornes containing GPI-IL-2 with an increased anti-tumor effect. Our study provides a feasible approach for exosome-based tumor immunotherapy of bladder trnssitional cell tumors.     

Trophoblast‐Derived Exosomes Mediate Monocyte Recruitment and Differentiation

Citation Atay S, Gercel‐Taylor C, Suttles J, Mor G, Taylor DD. Trophoblast‐derived exosomes mediate monocyte recruitment and differentiation. Am J Reprod Immunol 2011; 65: 65–77 Introduction Trophoblast cells have been demonstrated to regulate monocyte migration and differentiation, leading to pro‐inflammatory profiles. Because trophoblast cells release exosomes with immunoregulatory properties, trophoblast‐derived exosomes are proposed to ‘educate’ monocytes, creating a pro‐inflammatory environment. Method of study Exosomes were isolated from conditioned media of Swan71 cells by ultrafiltration and ultracentrifugation. Exosome‐induced migration was assessed using a two‐chamber system. Cytokine profiles were defined using cytokine arrays, and mRNA levels of affected cytokines were examined by qRT‐PCR and ELISA. Results Within 20 min, 8–10% of monocytes took up labeled exosomes isolated from Swan71 cells. Trophoblast‐derived exosomes increased monocyte migration in a dose‐dependent manner and produced significant increases in production of interleukin (IL)‐1β, IL‐6, Serpin‐E1, granulocyte colony‐stimulating factor, granulocyte/monocyte colony‐stimulating factor, and tumor necrosis factor‐α. Conclusion This study presents the initial demonstration that trophoblast‐derived exosomes are capable of recruiting and ‘educating’ monocytes to produce pro‐inflammatory cytokine/chemokine profiles in a cell‐contact‐independent manner.     

热休克诱导结直肠癌细胞外泌体的免疫效应

目的探讨热休克影响结直肠癌细胞外泌体诱导树突状细胞肿瘤相关蛋白因子的释放和细胞毒效应。方法临床经病理学确诊的结直肠管状腺癌细胞分离培养,43℃热休克1 h,四步离心获得细胞上清外泌体。诱导树突状细胞刺激细胞毒反应。酶联免疫测定树突状细胞释放TNF-α、MIP-1α、RANTES,MTT法测定对结直肠癌细胞的杀伤作用。结果结直肠癌细胞热休克获得的外泌体刺激DC分泌TNF-α、MIP-1α、RANTES,与对照组比较差异有统计学意义（P<0．05）。热休克促进外泌体诱导的结直肠癌细胞杀伤活性,与未经热休克培养获得的外泌体诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05),与结直肠癌细胞裂解物诱导组比较差异具有统计学意义(P<0.01),未经热休克培养获得的外泌体诱导组与癌细胞裂解物诱导组比较差异有统计学意义（P<0.05）。100 μg/ml剂量诱导效应强于50 μg/ml组。结论热休克培养可以通过促进效应细胞肿瘤相关蛋白因子释放,增强对结直肠癌细胞的杀伤活性,有剂量依赖性,为开拓高效无细胞疫苗来源提供了实验基础。     

外泌体在年龄相关性黄斑变性发病机制中的作用研究进展

外泌体是细胞分泌的纳米级膜性小泡,分布于多种体液,包括外周血、尿液、唾液等.目前多步差速离心是较为有效的外泌体提取方法.外泌体来源多样,可来自各种类型细胞,携带其来源细胞的蛋白质及核酸,参与细胞间的信息交流,在免疫调节、炎症反应等许多病理生理过程中发挥重要功能.年龄相关性黄斑变性(AMD)是引起50岁以上人群严重视力障碍的主要疾病,其发病机制尚不明确,目前认为AMD的发生与多种因素相关.最新研究表明,视网膜色素上皮(RPE)细胞分泌的外泌体可能与AMD的发生有关,RPE细胞通过外泌体释放的αB晶体蛋白等相关蛋白的增加可能导致玻璃膜疣的形成,氧化应激下的外泌体蛋白参与了RPE细胞的凋亡和存活.外泌体中的补体调节因子CD46、CD59通过损伤外层视网膜及Bruch膜参与AMD病程的进展.此外,RPE细胞的外泌体可能与脉络膜血管生成有关.随着对外泌体的深入研究,未来可能为AMD的诊治提供新的途径.