双调蛋白诱导乳腺癌细胞表达尿激酶型纤溶酶原活化物

目的:在人乳腺癌模型上研究双调蛋白与尿激酶型纤溶酶原活化物表达之间的关系.方法:乳腺癌NS2T2A1细胞经双调蛋白反义cDNA质粒转染后经潮霉素B筛选获得表达双调蛋白反义RNA的AR-AS1及AR-AS3两个细胞克隆,转染空载体获得NS2T2A1 V对照细胞,接种至裸鼠皮下形成肿瘤.测定细胞及肿瘤uPA表达水平,并研究uPA与细胞侵袭性之间的关系.结果:AR-AS1及AR-AS3细胞体外及体内uPA表达均被抑制.外源性双调蛋白可刺激对照细胞uPA的表达,并部分恢复AR-AS1及AR-AS3细胞uPA的表达水平.双调蛋白反义cDNA质粒转染及抗uPA抗体均导致乳腺癌细胞体外侵袭性的降低.结论:在乳腺癌模型上,uPA表达与肿瘤细胞的侵袭密切相关.双调蛋白反义RNA表达可有效地抑制uPA的表达,进而抑制肿瘤细胞的侵袭性.     

层黏连蛋白受体反义核酸对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究67 kD层黏连蛋白受体(67kDLN-R)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对卵巢癌细胞HRA体外侵袭转移能力的影响.方法:采用流式细胞仪、RT-PCR及Transwell小室的方法检测反义核酸对67 kD LN-R基因和蛋白表达影响,及转染前后细胞体外侵袭转移能力变化.结果:67 kD LN-R ASODN可从蛋白质和mRNA水平下调67kDLN-R的表达,且下调作用呈剂量依赖性.与正义组及对照组相比差异有显著性(P＜0.05).体外侵袭实验证实转染后HRA穿透人工基底膜的能力显著降低并呈现剂量依赖性.结论:67kDLN-R ASODN可降卵巢癌细胞体外侵袭转移能力,有望为卵巢癌治疗提供新方向.     

反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞EGFR表达的影响

目的　研究反义寡核苷酸 (ODN)对人视网膜色素上皮 (RPE)细胞表皮生长因子受体 (EGFR)表达的影响。方法　采用人工合成反义ODN经阳性脂质体包裹后转染人RPE细胞。采用半定量RT PCR法与ELISA法检测EGFRmRNA及蛋白的表达水平。结果　显示转染反义ODN 2 4h后 ,EGFRmRNA的表达抑制率为 35 .2 % ,EGFR蛋白抑制率为 6 6 .4 5 % .4 8h后 ,反义EGFRODNs对EGFR的表达抑制作用消失。结论　EGFR反义ODN可抑制人视网膜色素上皮细胞的EGFRmRNA及其蛋白的表达。     

病毒性肝炎的基因治疗进展

基因治疗是对病毒性肝炎防治极有潜力的治疗策略，两个肝炎基因治疗途径相关的基础研究正在进行：第一，基于核酸的抗病毒治疗途径，如通过转基因表达的反义寡核苷酸、反义RNA，核酶以及感染肝细胞核心蛋白负向变异决定簇的表达已被用于阻止病毒复制；第二条有效疫苗的基因治疗途径是通过发展载体来表达病毒抗原、辅助细胞因子及T细胞协同刺激分子。     

反向点杂交快速检测流感嗜血杆菌

目的　研究以分子杂交为基础的流感嗜血杆菌 (Hi)的快速检测方法。方法　将Hi探针固定在尼龙膜上 ;用标记有地高辛的细菌通用引物聚合酶链反应 (PCR)扩增不同细菌DNA ,产物分别与点有探针的膜条杂交。结果　 8种细菌均扩增出 4 6 8bp目的带 ,而人白细胞及轮状病毒DNA扩增均阴性。 6株Hi杂交阳性 ,7株其他临床常见菌杂交结果阴性。结论　反向点杂交法简便、快速、准确 ,是检测Hi的一种理想方法。     

微阵列技术结合免疫组化分析BRCA2在肺鳞癌中的表达

目的研究BRCA2(乳腺癌易感基因2)在肺鳞癌中的表达情况,以筛选肺鳞癌分子标志物。方法利用cDNA微阵列技术研究6个分期为Ⅰ期的手术切除鳞癌标本的基因表达谱,重点分析BRCA2的表达情况,并利用免疫组化方法测定其蛋白表达水平。结果BRCA2基因在全部6个肺鳞癌标本中均呈下调表达,免疫组化结果显示BRCA2蛋白在20个肺鳞癌标本中表达较低(与20例正常肺组织比较),与cDNA微阵列技术检测结果相符。结论cDNA微阵列技术结合免疫组化可用于肺鳞癌分子标志物的筛选,BRCA2可初步作为肺鳞癌的侯选分子标志物。     

反义EGFR寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ促VSMC增殖的影响

目的探讨脂质体介导的反义表皮生长因子受体寡核苷酸基因转染对血管紧张素Ⅱ促大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响．方法用反义表皮生长因子受体寡核苷酸脂质体复合物转染Sprague—Dawley大鼠血管平滑肌细胞，通过RT—PCR、Western—Bloting分别检测转染后EGFRmRNA及蛋白的表达情况，用^3H—Tdr掺入率实验检测经反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染再用血管紧张素Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞的增殖情况，结果反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染大鼠血管平滑肌细胞后，EGFRmRNA及蛋白的表达较正义组及对照组明显减少（P〈0．05）；用血管紧张素Ⅱ刺激后，反义组细胞的^3H—Tdr掺入较正义组及对照组明显降低，经方差分析两者有显著差异（P〈0．05），结论脂质体介导的反义表皮生长因子受体寡核苷酸转染减弱了血管紧张素Ⅱ的促血管平滑肌细胞增殖效应，证明了表皮生长因子受体在血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖中起重要作用．     

反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体联合转染对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体对人胆管癌细胞株QBC-939的增殖能力和细胞凋亡的影响。方法分别构建反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达载体,脂质体介导法将二者先后转染入QBC-939,经G418筛选和荧光细胞克隆挑选得到稳定转染细胞株,并用Western blot检测转染前后的蛋白表达变化;用MTT法和软琼脂克隆形成试验观察各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞生长周期及凋亡率的变化。结果Western blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因能影响QBC-939的生长曲线,使细胞增殖减慢,并以前者为甚;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因的细胞克隆形成率分别为(6.78±0.89)%和(14.86±2.13)%,明显低于未转染组;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G1期,细胞凋亡率从(1.63±0.27)%分别增加到(18.47±1.46)%和(6.19±0.78)%;在上述效应检测中,单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC-939细胞的生长无明显影响。结论通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达载体,能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,并促进凋亡的发生,其效果明显优于单独转染DNMT1反义基因;在DNA甲基化的过程中,DNMT1起着主要的作用,DNMT3b扮演着协同的角色,二者通过甲基化途径对胆管癌的发生发挥作用。     

核转录因子NF-κB对大鼠血管球囊损伤后新生内膜形成的作用

目的 探讨核因子κBp65亚基的反义和诱骗性寡核苷酸单独或联合作用对大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖和细胞基质金属蛋白酶的影响.方法 建立SD大鼠颈动脉球囊损伤模型.随机分为7组,每组分为6个时相点(6 h和1、3、5、7、14 d),每个时相点3只大鼠.结果 球囊损伤后7 d,模型组、正义组、诱骗对照组血管内膜/中膜比达到高峰,较正常组、反义组、诱骗组、反义+诱骗组显著升高(P＜0.05).球囊损伤后第3天,免疫组化检测细胞增殖标记物BrdU的掺入,与模型组相比,反义组、诱骗组、反义+诱骗组BrdU标记指数明显降低(P＜0.05).Western blot印迹法显示核因子κBp65蛋白表达在血管损伤后7 d达高峰.大鼠颈动脉损伤后7 d,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)蛋白表达在反义组、诱骗组、反义+诱骗联合治疗组均较各自对照组降低.结论 球囊损伤后血管平滑肌细胞增殖在不同时相点有动态变化;核因子κB反义和诱骗性寡核苷酸可抑制MMP-9的表达.