硫化型反义寡核苷酸逆转乳腺癌多药耐药的研究

多药耐药 (MDR)是恶性肿瘤化疗中经常遇到的现象 ,我们通过合成互补于多药耐药基因 1(Mdr 1)cDNA起始密码区的反义寡核苷酸 (ASODN ) ,以不同的浓度转染乳腺癌耐药细胞株 ,研究转染后 7d内实验细胞Mdr 1mRNA及其表达的P gp每天的变化情况 ,探讨A SODN转染肿瘤细胞的理想作用浓度和转染后出现最大逆转效果的时段。一、材料和方法1.细胞培养 :耐阿霉素的人乳腺癌细胞株MCF 7/ADR来自美国国立癌症研究所 ,常规方法进行培养 ,取对数生长期细胞进行实验。2 .ASODN的合成及修饰 :针对Mdr 1cDNA的起始密码区合成ASODN ,其碱基序…     

脂质体生存素反义寡核苷酸抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的探讨脂质体生存素反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及机理。方法将24只裸鼠建立人胃癌细胞系HS-746T皮下移植瘤模型,用不同的转染液处理后随机分成6组：空白对照组,脂质体组,正义链组,100、200和400nmol／L反义链组(ASODN组)。于注射相应试剂后2,4,8,12,16,20d观测裸鼠移植瘤体积,计算抑瘤率和肿瘤缩小率,观察移植瘤细胞形态变化,免疫组化SP法检测生存素的表达,并用逆转录聚合酶链反应技术(RT—PCR)和Western blot蛋白免疫印迹法比较治疗后不同时间各组肿瘤组织中生存素mRNA和蛋白表达的变化。结果注射后20d空白组、脂质体组和正义链组裸鼠的抑瘤率无明显差异,而ASODN组移植瘤的体积随着时间和浓度的增加而减小,肿瘤缩小率则增大,抑瘤率均大于对照组,400nmol／LASODN组抑瘤率最大为93％。光镜下见ASODN组移植瘤凋亡细胞数增多,生存素表达减弱,6例(6／12)肿瘤组织有坏死液化灶。各ASODN组均能够下调移植瘤细胞生存素mRNA含量,抑制生存素蛋白表达,注射20d后400nmol／L ASODN组蛋白表达为空白对照组的36．8％。结论生存素基因反义寡核苷酸能够通过诱导人胃癌裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡,下调生存素mRNA和蛋白的表达,抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。     

整合素连接激酶反义寡核苷酸对胃癌细胞的作用

目的探讨全硫代修饰整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)反义寡核苷酸(antisenseoligonucletide,ASODN)导入胃癌细胞株SGC-7901后对胃癌细胞的作用。方法(1)应用脂质体将ILK的ASODN导入胃癌细胞系SGC-7901,以RT-PCR及Western印迹方法检测作用后胃癌细胞ILK的mRNA和蛋白水平的变化;(2)应用MTS法及流式细胞术评价ILK的ASODN导入细胞后对其体外增殖和凋亡的影响。结果(1)转染后胃癌细胞ILK的蛋白表达水平明显下降,但mRNA水平无明显变化;(2)胃癌细胞生长受到明显抑制,抑制效应具有浓度依赖性,并可明显诱导细胞产生凋亡。结论ILK反义寡核苷酸导入胃癌细胞株SGC-7901后可以降低细胞内ILK的蛋白表达水平,并可体外抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡。     

反义c-fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响

目的:利用反义核酸技术和显微外科技术,探讨反义c-fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响.方法:选择20只新西兰家免,等分为实验组和对照组,均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术,实验组移植静脉周围和血管吻合口周围应用反义c-fos核酸凝胶涂布;对照组仅行凝胶涂布.术后2周取出移植血管,分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度,内膜平滑肌细胞数及PCNA阳性表达情况.结果:实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减少,PCNA阳性表达情况亦较对照组明显减少.结论:反义c-fos核酸可有效的抑制移植静脉内膜的增生,是一种比较有发展前途的防治移植静脉内膜增生的基因疗法.     

侧脑室注射NR1反义寡核苷酸对大鼠异氟烷最低肺泡浓度的影响

谷氨酸和天门冬氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质，通过不同的受体亚型介导兴奋性活动。兴奋性氨基酸受体分为N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA—R)和非NMDA—R，NMDA—R由5个亚型组成，即NR1、NP,2A～D，其中NR1是保证NMDA—R活性所必需的亚型。异氟烷的麻醉作用机制尚未阐明。为探讨NMDA—R及其亚型NR1在异氟烷麻醉中的作用，本研究拟通过中枢系统给药的方法观察反义NR1亚基寡核苷酸对大鼠异氟烷最低肺泡浓度(MAC)及翻正反射恢复时间(RTT)的影响。     

CpG寡核苷酸诱导人外周血单核细胞抗膀胱肿瘤BIU-87细胞的杀伤作用

目的 研究A型与B型CpG ODN对人外周血单个核细胞(PBMC)的增殖,细胞因子的释放和诱导人PBMC抗膀胱肿瘤细胞作用.方法 用A型、B型CpG ODN和NoCPG ODN刺激正常人外周血PBMC,MTT测定细胞的增殖,定量ELISA检测人干扰素-α含量,LDH法检测CpG ODN诱导后人PBMC对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用.结果 A型与B型CpG ODN对人PBMC增殖的刺激作用明显高于对照组;CpGODN2216组IFN-α的浓度高于CPG ODN2006组;CpG寡核苷酸作用后,人PBMC对BIU-87膀胱肿瘤细胞的杀伤活性明显升高.结论 A型与B型CpG ODN对人PBMC具有免疫诱导作用,可刺激人PBMC增殖并释放IFN-α,诱导免疫细胞对膀胱肿瘤细胞杀伤,增强宿主抗膀胱肿瘤细胞作用.     

阻滞真核细胞起始因子-4E对膀胱癌细胞乙酰肝素酶表达的影响

目的 探讨膀胱癌细胞真核细胞起始因子-4E( eIF-4E)与乙酰肝素酶表达的关系.方法 脂质体包裹eIF-4E于mRNA翻译起始点互补的反义寡核苷酸(asODN)及相应对照的正义寡核苷酸(sODN)以100、200 pmol/L两种浓度分别转染膀胱癌EJ细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测eIF-4E转录水平的改变.荧光定量PCR和Western blot分别检测乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达.结果 asODN转染显著抑制eIF-4E基因水平.eIF-4E被阻滞后,乙酰肝素酶mRNA水平及蛋白表达量:asODN1组(0.276±0.050、0.255±0.028)及asODN2组(0.195±0.022、0.160±0.032),均显著低于空白对照组(0.896±0.057、0.603±0.029)及sODN1组(0.867±0.099、0.572±0.029)和sODN2组(0.879±0.087、0.560±0.035,P＜0.01).结论 asODN转染膀胱癌EJ细胞可以阻滞eIF-4E基因表达,阻滞eIF-4E后,膀胱癌乙酰肝素酶mRNA水平及蛋白表达均明显降低.     

microRNA-29a在结直肠癌组织中的表达及意义

目的 探讨microRNA-29a（miR-29a）在结直肠癌组织中的表达,以及miR-29a反义寡核苷酸对结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响。方法 选取行手术治疗的初诊结直肠癌患者195例,利用实时荧光定量聚合酶链反应检测结直肠癌和癌旁组织中miR-29a表达,培养人结直肠癌LoVo细胞,随机分为ASO-miR-29a组、ASO-对照序列组和空白对照组,检测各组细胞中miR-29a表达,MTT法检测各组细胞增殖能力,Transwell小室检测各组细胞迁移和侵袭能力。结果 结直肠癌组织miR-29a相对表达量为（1.93±0.19）,癌旁组织为（1.26±0.12）,两者比较差异有统计学意义（P?<0.05）;结直肠癌组织中miR-29a相对表达量与TNM分期和淋巴结转移有关（P?<0.05）,多元线性回归分析结果显示,TNM分期和淋巴结转移是影响结直肠癌组织中miR-29a表达的因素（P?<0.05）;ASO-miR-29a组细胞中miR-29a相对表达量低于ASO-对照序列组和空白对照组（P?<0.05）;MTT实验结果显示,ASO-miR-29a组与ASO-对照序列组和空白对照组相比吸光度值降低（P?<0.05）;与ASO-对照序列组和空白对照组比较,ASO-miR-29a 组迁移细胞数和侵袭细胞数均减少（P?<0.05）。结论 miR-29a在结直肠癌组织中呈高表达,参与结直肠癌发生、进展过程,特异性抑制结直肠癌细胞中miR-29a表达可减少细胞增殖,抑制细胞迁移和侵袭能力。     

亨廷顿病基因治疗的进展与挑战

亨廷顿病是一种常染色体显性遗传病,基因治疗是控制病情进展甚至实现根治的有效手段。随着反义核苷酸疗法在亨廷顿病基因治疗中获得初步成功,针对基因组水平及mRNA水平的各项技术也正在积极开发、改良,在不久的将来相继开展临床试验。本文围绕亨廷顿病基因治疗的现状、发展方向及临床挑战,开展相关研究状况的综述。     

联合转染反义c-myc寡核苷酸和组织纤溶酶原激活物基因预防损伤后动脉内膜增生的研究

目的观察血管局部联合转染c-myc反义寡核苷酸(AODN)和组织纤溶酶原激活物(tPA)基因对损伤后动脉内膜增生的影响。方法将同一只兔的左、右髂外动脉(各1·0cm)对换移植,移植血管分别用脂质体、c-myc-AODN和pBudCE4·1/tPA液浸泡,血管吻合口用上述3种液体浸泡过的缝线吻合。实验终点(术后3、7、14、28、56d)分为5个亚组,术后各实验终点取移植血管标本用于病理学检测、发色底物法检测tPA活性实验、3H-TdR掺入实验和免疫组织化学染色检测。结果术后各时间点联合转染组血管的内膜面积、管腔狭窄程度、3H-TdR掺入量和增值细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数均显著低于对照组(P<0·01),而且亦明显低于c-myc-AODN和tPA单独转染组(P(0·05)。结论血管局部联合转染c-myc-AODN和tPA基因能有效抑制内膜增生,防止损伤血管狭窄。