雷公藤有效部位提取纯化工艺研究进展

从药效物质基础、提取纯化工艺等方面,对雷公藤有效部位提取纯化工艺研究进行综述。雷公藤提取物具有显著的抗炎及免疫抑制作用,其有效部位主要包括二萜类、生物碱类和三萜类,其中很多成分既是抗炎免疫抑制的有效成分,又是毒性成分。文献报道及市售制剂存在提取纯化工艺不一致、工艺指标选择不够全面、使用毒性大的限制级有机溶剂等问题,造成不同制剂质量和疗效差别很大。有必要引入谱效结合的研究方法,对雷公藤进行更深入研究,建立一种安全、有效的提取纯化工艺。     

大孔吸附树脂纯化胡芦巴提取物中4-羟基异亮氨酸的研究

目的：优选出纯化胡芦巴提取物中4-羟基异亮氨酸的大孔树脂,并确定相应的最佳工艺条件。方法：以胡芦巴提取物中4-羟基异亮氨酸含量为评价指标,采用柱前衍生-高效液相色谱法检测24种型号大孔树脂静态吸附试验前后4-羟基异亮氨酸（4-HIL）含量变化来考察其纯化效果。结果：24种型号大孔树脂对4-HIL吸附容量均很低,但ADS-5型大孔树脂可用于胡芦巴提取物中4-HIL初步纯化,最佳工艺条件为采用ADS-5型大孔树脂,上样液浓度为0.04g?mL^-1,上样量为60mL,上样流速为2BV?h^-1,收集续滤液蒸干可得。结论：ADS-5大孔树脂可用于其初步除杂。     

连续性血液净化治疗重症心力衰竭合并肾衰竭患者的疗效分析

目的 探讨应用连续性血液净化（CBP）治疗重症心力衰竭合并肾衰竭的价值。方法选择广州医学院第二附属医院危重病科2003年6月-2007年9月应用CBP治疗的19例重症心力衰竭合并肾衰竭患者资料进行回顾性分析。观察患者治疗前后血生化、动脉血气分析、血压、呼吸频率、心率、氧合指数和左心室射血分数的改变。治疗前后记录Boston心力衰竭积分、APACHE Ⅱ评分。结果 14例患者心功能明显改善，有效率73．7％：CBP治疗后患者血肌酐、血尿素氮很快下降，内环境能维持在相对稳定的水平；氧合功能逐渐改善，Boston心力衰竭积分和APACHE Ⅱ评分明显降低；治疗过程生命征稳定，低血压和心律失常发生率低。结论 CBP能平稳地清除水分和溶质并保持血流动力学的稳定，可以安全有效地应用于重症心力衰竭合并肾衰竭的治疗。     

重组人tumstatin的原核生物表达和多克隆抗体制备

目的原核生物表达可溶性的tumstatin抗原并制备相应的多克隆抗体。方法利用原核表达载体pMAL-tumstatin在大肠埃希菌BL21中表达tumstatin,经Amylose Resin亲和层析柱和Q Sepharose Fast Flow柱纯化tumstatin,以纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗tumstatin多克隆抗体。利用western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果tumstatin蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为可溶性表达。成功获得了tumstatin纯品及兔抗tumstatin多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>5 000。western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功表达、纯化tumstatin蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗tumstatin多克隆抗体,为其在临床免疫学检测应用奠定了基础。     

Artificial liver support: future aspects

Liver transplantation and blood purification therapy, including plasmapheresis, hemodiafiltration, and bioartificial liver support, are available to treat patients with severe liver failure. The two mainstream systems developed for bioartificial liver support are extracorporeal whole-liver perfusion (ECLP) and the bioreactor system (BIS). We developed a method of plasma cross-perfusion, in which plasma is exchanged between the blood circuit of the patient and that of a hepatic function unit, that is, whole liver or a bioreactor through which immunologically free whole human blood is perfused. From the aspects of efficacy and safety, the best system of bioartificial liver support for clinical use is considered to be ECLP in cross plasma perfusion. However, a social objection about zoonosis has consistently been raised, with controversy surrounding the use of xenogeneic organs for human treatment, and this might be a final obstacle to the development of system efficacy. The combination therapy of hemodiafiltration with the administration of human serum albumin and anticoagulant factors can minimize the economic and medical resource costs through the development of transgenic livestock that secrete human pharmaceuticals systemically. It is possible that this therapy will become the most practical treatment for patients with severe hepatic failure.     

大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

灭活SARS病毒的纯化鉴定及初步应用

为制备纯化的灭活SARS病毒,取广东省CDC提供的灭活SARS-CoV病毒培养液进行超滤,收集相对分子质量介于100000至500000之间的组分,并浓缩。对纯化过程中各组分进行抗原活性鉴定和蛋白质含量测定,并加佐剂后免疫动物,测定抗体免疫应答。结果表明,超滤后活性抗原蛋白质回收率7.6%,纯化倍数为9,抗原活性达到1:480。免疫家兔获得的血清ELISA效价达到1:10000以上,中和抗体效价达到1:2000以上。表明该纯化工艺能获得较高纯度的灭活SARS-CoV病毒颗粒。     

一种快速分离纯化外周血细胞线粒体DNA方法的建立

目的探索快速分离纯化人外周血细胞线粒体DNA(mtDNA)的方法. 方法收集抗凝外周血,首先破红细胞,然后裂解白细胞,去除细胞膜和核DNA后获得mtDNA;再经过去除蛋白和RNA,获得纯mtDNA.用PCR扩增人线粒体ND1基因片段,PCR产物经纯化后测序和核苷酸同源性分析.结果用本研究中建立的方法制备的mtDNA纯度高,每毫升抗凝血可获得100ng左右的mtDNA.经过PCR扩增ND1基因433bp片段,较用细胞总DNA为模板,模板用量少,扩增产物多.测序后经核苷酸同源性分析证实扩增片段为ND1基因.结论本研究中建立的快速分离外周血细胞mtDNA的方法,可制备高纯度的mtDNA用于线粒体相关研究.     

一种新槲寄生蛋白A链的基因克隆及序列分析

目的克隆槲寄生蛋白具有N-糖苷酶活性的毒性A链。方法利用硫酸铵沉淀、亲和色谱和离子交换色谱法,从吉林产槲寄生[Viscum coloratum(Komar．)Nakai]中提取、分离、纯化其中具有半乳糖结合活性的蛋白质成分。采用SDS-PAGE分析纯化的蛋白样品,蛋白条带转印至PVDF膜后,Edman降解法测定肽链的N端序列。由测序结果设计引物,利用RT-PCR方法克隆一种蛋白A链的基因。结果从槲寄生中纯化出两种高毒性的蛋白质新成分CM-1、CM-2,其中CM-1 A链被克隆并测序,其与白果槲寄生蛋白A链的同源性较高。结论一种新槲寄生蛋白A链的基因被成功克隆。     

非受体型酪氨酸激酶-Syk蛋白的提取与纯化

目的 :从转染syk基因的Sf2 1细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk蛋白。方法 :将syk基因转染Sf2 1细胞 ,于 2 8℃培养 48h ,收集细胞 ,用超声波破碎仪裂解细胞 ,提取裂解液中总蛋白 ,用Yellow 3凝胶和Toyopearl AF Heptin 650M凝胶层析柱分离、纯化。层析液中的Syk蛋白存在和性质 ,用SDS PAGE、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定。结果 :从 2 5亿个Sf2 1细胞裂解液中提取了含有Syk的 2 2 5mg蛋白质。经Yellow 3凝胶层析分离 ,得到两个亚种的Syk蛋白 ,相对分子质量 (Mr)均为72× 10 3 。进一步用Toyopearl AF Heptin 650M凝胶层析纯化后 ,得到两个纯的Syk蛋白 ,SDS PAGE、免疫印迹实验结果显示 ,两种Syk的Mr 均为 72× 10 3,与Syk的理论相对分子质量吻合。但等电聚焦实验显示 ,这两种Syk蛋白成分具有不同的pI值。结论 :从 2 5亿个转染syk基因的Sf2 1细胞中纯化出8mgSyk蛋白 ,纯度高于 95%。这两种Syk的Mr 虽然相同 ,但具有不同的pI值 ,是两个亚种。这些Syk可用于研究Syk的作用机制、抗Syk抗体的制备和Syk诊断试剂盒的制备等