皮肤细胞蛋白质组质谱分析方法的建立及肽质量指纹图谱的构建

目的建立人皮肤细胞蛋白质组学研究所需的质谱分析方法,并获得皮肤细胞蛋白质肽质量指纹图谱。方法体外培养人皮肤成纤维细胞与角质形成细胞,采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离其总蛋白质,凝胶经染色后,在图谱上选取2个角质形成细胞蛋白点与1个成纤维细胞蛋白点,进行胶内酶切、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析鉴定。结果获得3个点的肽质量指纹图谱,经Mascot软件搜索人非冗余蛋白质数据库后,鉴定为细胞骨架Actingamma1、tubulinα2及热休克蛋白HSP70。结论皮肤细胞基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析技术的建立为皮肤蛋白质组学的进一步研究提供手段。     

Expression Profile of Human Renal Mesangial Cells Is Altered by Infection with Pathogenic Puumala Orthohantavirus

Acute kidney injury (AKI) with proteinuria is a hallmark of infections with Eurasian orthohantaviruses. Different kidney cells are identified as target cells of hantaviruses. Mesangial cells may play a central role in the pathogenesis of AKI by regulation of inflammatory mediators and signaling cascades. Therefore, we examined the characteristics of hantavirus infection on human renal mesangial cells (HRMCs). Receptor expression and infection with pathogenic Puumala virus (PUUV) and low-pathogenic Tula virus (TULV) were explored. To analyze changes in protein expression in infected mesangial cells, we performed a proteome profiler assay analyzing 38 markers of kidney damage. We compared the proteome profile of in vitro-infected HRMCs with the profile detected in urine samples of 11 patients with acute hantavirus infection. We observed effective productive infection of HRMCs with pathogenic PUUV, but only poor abortive infection for low-pathogenic TULV. PUUV infection resulted in the deregulation of proteases, adhesion proteins, and cytokines associated with renal damage. The urinary proteome profile of hantavirus patients demonstrated also massive changes, which in part correspond to the alterations observed in the in vitro infection of HRMCs. The direct infection of mesangial cells may induce a local environment of signal mediators that contributes to AKI in hantavirus infection.     

一种新的双向电泳蛋白样品制备方法

目的探讨双向凝胶电泳（2-DE）样品裂解液对蛋白质分离和双向凝胶电泳结果的影响。方法以MOLT-4细胞为例，采用3种溶解性能不同的裂解液提取细胞中的蛋白质组，并分别进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果通过对2-DPAGE图谱的比较分析，发现采用8mol／L Urea，2mol／L Thiourea，4％CHAPS，1％NP-40.4％Triton X-100，65mmol／LDTT，0．5mmol／LPMSF，0．5％pharmalyte3-10，能获得质量较高的2-DE图谱。结论采用高浓度脲、三去污裂解液有利于获得优质的蛋白质样品，从而提高蛋白质提取率和双向电泳分辨率等。     

双向电泳质谱法研究女性肺腺癌转移淋巴结的蛋白表达

目的:分析肺腺癌转移淋巴结与正常淋巴结组织蛋白质表达差异.方法:运用蛋白质组技术,对肺腺癌转移淋巴结与正常淋巴结组织蛋白质进行分离和比较分析,并在蛋白质和mRNA水平进行进一步验证.结果:获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,比较分析显示与正常淋巴结蛋白质表达水平相比,肺腺癌转移淋巴结有23个蛋白点的表达量存在明显差异.其中新增蛋白点4个,缺失1个,14个蛋白点表达水平明显上调,4个蛋白点表达水平明显下调.共鉴定了11个肺癌转移相关蛋白,其中,候选蛋白膜联蛋白1(ANX1)、细胞骨架蛋白(CK18)、Rho-GDP解离抑制剂1(GDIR)、原肌球蛋白3(TPMF)、蛋白谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶(TGLC)和白介素18(IL-18)在肺腺癌转移淋巴结显著低表达,而候选蛋白核氯离子通道蛋白1(CLI1)、蛋白质二硫键异构酶(ER60)、肌酸激酶、硫氧还蛋白过氧化物酶1(PDX1)和热休克蛋白60(CH60)在肺腺癌转移淋巴结表达水平比正常淋巴结明显提高.结论:肺腺癌转移淋巴结与正常淋巴结蛋白质表达存在明显差异,这11种蛋白质可能与肺腺癌淋巴结转移机制有关.     

应用激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌蛋白质表达谱的建立

目的：建立鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究奠定基础。方法：应用激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）技术从NPC组织纯化NPC细胞,应用二维凝胶电泳（2-DE）分离LCM 纯化NPC细胞的蛋白质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白质,利用生物信息学资源构建NPC的2-DE蛋白质组数据库。 结果：建立了NPC蛋白质2-DE参考图谱,2-DE图谱共显示（1 312±30）个蛋白质点,共鉴定了427个蛋白质点,包括241个非冗余蛋白质,并构建了NPC的2-DE蛋白质组数据库,这些数据可从本实验室网站(http://www.xyproteomics.org)上进行查询。结论：首次建立了LCM纯化NPC细胞2-DE蛋白质表达谱,为NPC蛋白质组学研究提供了重要的信息和资料。     

在固相pH梯度4~7范围内海洛因成瘾者血浆蛋白质组分析(英文)

目的比较鉴定海洛因成瘾者和正常人血浆蛋白质组差异,为研究海洛因成瘾相关血浆蛋白提供线索。方法海洛因成瘾者(n=5)和正常对照者(n=5)血浆蛋白经剔除白蛋白和免疫球蛋白IgG后,以固相pH梯度4~7胶条等电聚焦为第一向,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,进行蛋白双向电泳。图像分析软件Image Master Elit 5.0分析蛋白质2维图谱。手工挖取组间相差1.5倍的差异点,串联质谱分析鉴定。结果每张图谱平均检测到350±21个蛋白(亚基)斑点,其中5个蛋白点在2组图谱中差异1.5倍以上,鉴定结果分别为γ纤维蛋白原、人α1B糖蛋白、α1-抗胰蛋白酶原、视黄醇结合蛋白载体蛋白四聚体单体和铜蓝蛋白。结论海洛因成瘾者血浆与正常人血浆对比存在蛋白质组差异。某些差异蛋白可能与海洛因成瘾造成的神经损伤相关。     

蛋白质组学技术的研究

本文讨论了蛋白组学对人体疾病研究的意义。采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、激光捕获显微切割、质谱技术等研究方法。结合数据库和分析软件对实验结果的分析,探索在蛋白质水平上的作用模式、功能机理、调节、调控,以及蛋白质群组内相互作用。为各种全身疾病的早期诊断,进展监测,新靶点的确定提供了重要依据。     

蛋白质组技术在胃癌相关标志物筛查中的应用

Objective:To initially explore the application of proteome technologies in study of serum,to establish two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) profiles of human gastric cancer serum and paired normal serum,and to screen and identify differentially expressed proteins in poorly-differentiated gastric cancer serum and paired normal serum,in which try to find out significant biomarker candidates for gastric cancer.Methods:2-DE was adopted to separate the total proteins of poorly-differentiated gastric cancer serum and paired normal serum.After staining and analyzing by ImageMaster 2D Elite software,the differentially expressed proteins were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight- mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).Results:2-DE serum profiles with high resolution were obtained.Five protein spots were found as differentially-expressed proteins and identified as Serpin B6 (Placental thrombin inhibitor) Cytoplasmic antiproteinase (CAP)(Protease inhibitor6) (P1-6),Septin-1 (LARP) (Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-24),Kallikrein-6 precursor (Protease M) (Neurosin) (Zyme) (SP59),Hemoglobin beta chain,Hemoglobin beta chain and Beta-defensin 108 precursor (Beta-defensin 8) (DEFB-8).Conclusion:The differential proteins were demonstrated to present in poorly-differentiated gastric cancer serum and paired normal serum.The molecular biomarkers associated with poorly differentiated gastric cancer could be possibly identified by the high throughput screening proteome technology.     

沙棘总黄酮和广枣总黄酮对大鼠缺血心肌组织蛋白质表达的比较

目的：探讨比较沙棘总黄酮（TFH）和广枣总黄酮（TFC）对缺血心肌的保护作用及其相关蛋白表达谱的改变。方法：应用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片技术检测了经TFH和TFC处理后的缺血心肌组织和未经处理的的对照组缺血心肌组织中的蛋白质谱。用PHSII-C型蛋白芯片阅读机读取数据并进行比较分析。结果：与对照组的缺血心肌组织相比，经TFH处理后的缺血心肌组织3种芯片共捕获6个存在有差异的蛋白质峰，其中有1个呈高表达，有5个呈低表达；经TFC处理后的缺血心肌组织3种芯片共捕获7个存在有差异的蛋白质峰，其中有2个呈高表达，有5个呈低表达：TFH和TFC比较，各蛋白质表达峰的强度有所差别。结论：TFH和TFC均可从蛋白质水平进行调节从而产生抗心肌缺血作用，但它们所影响的蛋白种类、数量及作用机制均有所差别。