延龄草总皂苷调控hsa_circ_0025033/miR-149对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响

目的:研究延龄草总皂苷对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:将不同浓度的延龄草总皂苷作用于A549细胞,应用实时定量PCR检测hsa_circ_0025033和miR-149的表达,应用双荧光素酶基因系统验证hsa_circ_0025033与miR-149的靶向关系。分析干扰hsa_circ_0025033表达对A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:延龄草总皂苷可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,下调hsa_circ_0025033表达,上调miR-149表达(P＜0.05)。干扰hsa_circ_0025033可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡(P＜0.05)。hsa_circ_0025033可靶向结合miR-149,干扰hsa_circ_0025033表达可上调miR-149表达(P＜0.05)。过表达hsa_circ_0025033逆转延龄草总皂苷对A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响(P＜0.05)。结论:延龄草总皂苷能够抑制NSCLC细胞A549增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,可能与调节hsa_circ_0025033/miR-149通路有关。     

微小RNA-181b-5p对皮肤黑素瘤细胞株增殖和侵袭的作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨微小RNA（miRNA）-181b-5p是否通过靶向普列克底物蛋白（PLEK）抑制皮肤黑素瘤（CM）细胞的增殖及侵袭能力。方法 生物信息学分析CM核心基因;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181b-5p和PLEK的靶向结合。采用RNA oligo和siRNA分别调控A375细胞miRNA-181b-5p和PLEK的表达,具体分组为：模拟物阴性对照组、miRNA-181b-5p模拟物组、抑制剂阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂组、PLEK siRNA组、siRNA阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂和对照siRNA共转染组以及miRNA-181b-5p抑制剂和PLEK siRNA3共转染组。上述各组用相应试剂处理细胞48 h后,采用qPCR检测A375细胞中miRNA-181b-5p和PLEK mRNA的表达,Western印迹检测PLEK蛋白的表达,Transwell小室侵袭实验检测A375细胞的侵袭能力;继续培养24 ~ 96 h后,CCK8实验检测A375细胞增殖能力。结果 PLEK为CM的核心基因,CM原位癌组织较癌旁组织高表达PLEK（P = 0.031）,转移组织较原位癌组织高表达PLEK（P = 0.001）。与人表皮黑素细胞HEMa-LP相比,A375细胞高表达PLEK mRNA（3.884 ± 0.156比0.997 ± 0.010,t = 18.48,P < 0.001）及PLEK蛋白（2.840 ± 0.301比1.029 ± 0.094,t = 5.47,P = 0.005）,低表达miRNA-181b-5p（0.333 ± 0.042比0.967 ± 0.069,t = 7.83,P = 0.001）。双荧光素酶报告基因实验显示,miRNA-181b-5p和PLEK靶向结合。与模拟物阴性对照相比,miRNA-181b-5p模拟物转染后A375细胞的存活率显著降低（48 h,t = 7.96,P = 0.015;72 h,t = 7.50,P = 0.002;96 h,t = 7.96,P = 0.001）,侵袭能力也显著降低（t = 5.07,P = 0.007）;相反miRNA-181b-5p 抑制剂组A375细胞存活率高于抑制剂阴性对照组（24 h,t =5.38,P = 0.013;48 h,t = 5.36,P = 0.013;72 h,t =7.63,P = 0.005;96 h,t =5.99,P = 0.004）,侵袭能力也高于抑制剂阴性对照组（t = 7.24,P = 0.002）;与对照siRNA组相比,PLEK siRNA转染后A375细胞的增殖能力降低（48、72、96 h时,P值分别为0.015、0.011、0.001）,侵袭能力也降低（t = 4.93,P = 0.008）;与miRNA-181b-5p 抑制剂和对照 siRNA共转染组相比,miRNA-181b-5p 抑制剂和PLEK siRNA共转染组A375细胞的增殖率明显降低（24、48、72、96 h时,P值分别为0.042、0.042、0.037、0.017）,侵袭能力也明显降低（t = 8.52,P = 0.001）。结论 miRNA-181b-5p抑制A375细胞增殖和侵袭能力,其机制涉及靶向下调PLEK的表达。     

苦木碱F通过miR-331-3p调控宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的机制研究

目的:探讨苦木碱F调控miR-331-3p在宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡中的作用及机制。方法:MTT法检测苦木碱F对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响; 流式细胞术检测苦木碱F对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响; RT-qPCR检测苦木碱F处理HeLa细胞后miR-331-3p的表达; miR-331-3p mimic或miR-331-3p inhibitor 转染HeLa细胞,经苦木碱F处理后检测HeLa细胞的增殖及凋亡情况; 使用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验预测及验证miR-331-3p与蛋白酶体活化复合物3(PSME3)的靶向关系; Western blot检测HeLa细胞中凋亡相关蛋白表达情况。结果:苦木碱F能显著抑制HeLa细胞增殖,促进凋亡,且具有浓度依赖性(P<0.01); 苦木碱F显著上调HeLa细胞中miR-331-3p的表达(P<0.01); miR-331-3p mimic能显著抑制HeLa细胞增殖能力,促进细胞凋亡; miR-331-3p inhibitor能显著降低苦木碱F对HeLa细胞增殖的抑制以及凋亡的促进作用(P<0.05); 生物信息学预测PSME3是miR-331-3p的靶基因之一,双荧光素酶报告基因结果显示miR-331-3p与PSME3 3'UTR靶向结合; 与苦木碱F+NC inhibitor +NC-siRNA组比较,苦木碱F+miR-331-3p inhibitor +NC-siRNA组中细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,β-catenin和Bcl-2蛋白水平升高,Bax蛋白水平降低,而敲低PSME3能逆转这一结果,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:苦木碱F通过介导miR-331-3p/PSME3轴抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,促进凋亡,发挥抗肿瘤作用。     

miR-204-5p在氧糖剥夺/复糖复氧致SH-SY5Y细胞损伤中的作用研究

目的观察miR-204-5p在氧糖剥夺/复糖复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)致人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤中的作用并从炎症/凋亡途径探讨其机制。方法 SH-SY5Y细胞分为control组、OGD/R组、OGD/R+miR-204-5p mimic组、OGD/R+miR-204-5p inhibitor组、OGD/R+miR-204-5p mimic negative control组、OGD/R+miR-204-5p inhibitor negative control组。采用MTT法测定细胞增殖、流式细胞术、TUNEL染色法检测细胞凋亡、酶联免疫法检测炎症因子(IL-10、IL-1β、TNF-α、PGE2)含量、qRT-PCR检测miR-204-5p的表达、western blot检测炎症及凋亡相关蛋白(COX-2、Bcl-2、Bax)的表达。结果与对照组相比,OGD/R组细胞miR-204-5p表达显著降低,IL-1β、TNF-α、PGE2含量增多,IL-10含量减少,COX-2、Bax蛋白水平上升,Bcl-2蛋白水平下降,细胞损伤明显加重;与OGD/R组比较,miR-204-5p mimic下调COX-2、Bax蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达,IL-10含量增加,IL-1β、TNF-α、PGE2含量减少,细胞活力明显增加、凋亡率显著降低,细胞损伤减轻。结论 miR-204-5p对OGD/R致SH-SY5Y细胞损伤具有明显保护作用,其机制可能与减轻细胞炎症和凋亡有关。     

知母皂苷AⅢ调控miR-494对原发性皮肤黑色素瘤生物学行为的影响

目的:探讨知母皂苷AⅢ调控miR-494对原发性皮肤黑色素瘤增殖、迁移和侵袭的影响。方法:体外培养人黑色素瘤A375细胞,分别用0、4、8、16 μmol/L的知母皂苷AⅢ处理A375细胞24 h。将miR-NC、miR-494转染至A375细胞,作为miR-NC、miR-494组; 将anti-miR-NC、anti-miR-494转染至A375细胞,再用知母皂苷AⅢ(16 μmol/L)干预,作为anti-miR-NC+16 μmol/L组、anti-miR-494+16 μmol/L组。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖情况; 蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达; Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况; 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测细胞miR-494表达水平。结果:与对照组比较,8、16 μmol/L中、高剂量组的知母皂苷AⅢ明显下调组细胞A值、迁移数量和侵袭数量以及Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05)。与对照组比较,8 μmol/L中剂量组、16 μmol/L高剂量组的知母皂苷AⅢ明显上调细胞miR-494表达水平(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-494组细胞A值、迁移数量和侵袭数量以及Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低(P<0.05)。与anti-miR-NC+16 μmol/L组比较,anti-miR-494+16 μmol/L组细胞miR-494表达水平显著降低; 细胞A值、迁移数量和侵袭数量以及Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:知母皂苷AⅢ上调miR-494抑制原发性皮肤黑色素瘤增殖、迁移和侵袭。     

miR-30-5p通过下调FOXG1表达抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖

目的 探讨miR-30-5p对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响及作用机制。 方法 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-30-5p在视网膜母细胞瘤细胞系和人视网膜内皮细胞(HRECs)中的表达。利用TargetScan数据库进行生物信息学分析并预测miR-30-5p靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miR-30-5p与FOXG1的3'UTR结合能力及靶向关系,qRT-PCR和Western blotting分别检测miR-30-5p对FOXG1的mRNA与蛋白表达影响。瞬时转染Y79细胞后,通过CCK8法检测各组Y79细胞的增殖。 结果 与HRECs比较,miR-30-5p在视网膜母细胞瘤细胞中表达降低,FOXG1在视网膜母细胞瘤细胞中表达升高。生物信息学预测结果显示miR-30-5p与FOXG1存在结合位点,qRT-PCR和Western blotting显示miR-30-5p可负调控FOXG1的mRNA和蛋白的表达,双荧光素酶实验结果证实miR-30-5p与FOXG1 3'UTR存在靶向关系。瞬时转染miR-30-5p可升高Y79细胞中miR-30-5p的表达水平,抑制Y79细胞的增殖活力。过表达FOXG1可逆转miR-30-5p上调对Y79细胞增殖的影响。 结论 miR-30-5p通过下调FOXG1表达抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖。     

血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p联合检测对妊娠期糖尿病的诊断价值

目的探讨血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p对妊娠期糖尿病的诊断价值。方法选择2018年5—6月该院收治的妊娠期糖尿病患者10例和妊娠24~28周的健康孕妇10例,采用转录组测序技术(RNA-seq)分析血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平。选择2018年5月至2020年5月该院收治的妊娠期糖尿病患者100例为观察组,妊娠24~28周的健康孕妇100例为对照组。通过实时荧光定量PCR检测2组受试者血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p单独或联合检测对妊娠期糖尿病的诊断价值。结果RNA-seq检测结果显示,10例妊娠期糖尿病患者血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平较10例健康孕妇高8倍以上。观察组血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p单独检测对妊娠期糖尿病的诊断灵敏度分别为95%、97%、94%,特异度分别为95%、96%、95%,血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p联合检测对妊娠期糖尿病的诊断灵敏度为98%,特异度为93%,准确性为96%。结论血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p可作为妊娠期糖尿病的潜在诊断标志物。     

血清miR-33a、miR-29c、miR-126联合检测对脑动脉粥样硬化的诊断价值

目的探讨血清miR-33a、miR-29c、miR-126联合检测对脑动脉粥样硬化的诊断价值。方法选择2018年1月至2020年1月该院收治的脑动脉粥样硬化患者120例为研究组,同期体检健康者120例为对照组。根据不同脑动脉硬化严重程度将患者分为单动脉组(23例)、双动脉组(53例)、多动脉组(44例)。采用实时荧光定量PCR检测研究组与对照组及不同脑动脉粥样硬化严重程度患者血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相对表达水平。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清miR-33a、miR-29c、miR-126对脑动脉粥样硬化的诊断价值。结果研究组血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相对表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同脑动脉粥样硬化严重程度患者中的相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-33a、miR-29c、miR-126单项检测对脑动脉粥样硬化诊断的灵敏度分别为95.00%、93.00%、92.00%,特异度分别为95.00%、92.00%、91.00%。血清miR-33a、miR-29c、miR-126联合检测对脑动脉粥样硬化诊断的灵敏度为96.67%,特异度为90.00%,准确度为93.33%。结论血清miR-33a、miR-29c、miR-126可作为联合诊断脑动脉粥样硬化的潜在标志物。     

白藜芦醇通过抑制miR-27b表达促进白色脂肪细胞的棕色化功能

目的:探讨白藜芦醇对小鼠原代白色脂肪细胞棕色化功能的影响,研究白藜芦醇调控白色脂肪棕色化功能可能的分子机制?方法:从C57BL/5J小鼠的腹股沟处分离皮下前脂肪细胞,诱导分化后使用不同浓度的白藜芦醇(0~50 μmol/L)刺激48 h,运用RT-PCR检测棕色标志因子基因及相关的miR-27b表达情况?为了验证miR-27b的作用,在细胞内过表达miR-27b,同时予白藜芦醇刺激,运用RT-PCR和Western blot检测相关重要转录因子的基因及蛋白表达?结果:白藜芦醇促进了小鼠原代白色脂肪细胞棕色化功能基因的表达,抑制了原代白色脂肪细胞miR-27b表达,并呈剂量效应?过表达miR-27b显著抑制了白藜芦醇增强棕色化标志基因mRNA表达的作用?在蛋白水平上,过表达miR-27b同样抑制了白藜芦醇增强其靶基因PRDM16和棕色标记基因UCP1蛋白表达的作用?结论:白藜芦醇通过抑制miR-27b表达增强了白色脂肪细胞的棕色化功能,从而为临床有效改善机体能量代谢?防治代谢综合征提供了新策略?     

Oncogenic circDHTKD1 promotes tumor growth and metastasis of oral squamous cell carcinoma in vitro and in vivo via upregulating miR-326-mediated GAB1

Circular RNAs (circRNAs) have been extensively elucidated with regard to their significant implications in oral squamous cell carcinoma (OSCC). This study performed the functional investigation of circRNA dehydrogenase E1 and transketolase domain containing 1 (circDHTKD1) in OSCC. RNA expression levels of different molecules were measured via quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Cellular behaviors were detected by 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) for cell viability, colony formation assay for clonal capacity, flow cytometry for cell apoptosis, wound healing assay for migration, and transwell assay for migration/invasion. Western blot was used for analyzing protein expression. RNA pull-down and dual-luciferase reporter assays were applied to assess the binding between targets. A xenograft tumor model was established in nude mice for in vivo experiments. Our expression analysis revealed that circDHTKD1 was upregulated in OSCC tissues and cells. circDHTKD1 knockdown was shown to impede OSCC cell growth and metastasis but motivate apoptosis. Additionally, circDHTKD1 served as a microRNA-326 (miR-326) sponge and the function of circDHTKD1 was achieved by sponging miR-326 in OSCC cells. Also, miR-326 inhibited OSCC development via targeting GRB2-associated-binding protein 1 (GAB1). circDHTKD1 could sponge miR-326 to alter GAB1 expression. Furthermore, circDHTKD1 contributed to OSCC progression in vivo via the miR-326/GAB1 axis. These data disclosed a specific circDHTKD1/miR-326/GAB1 signal axis in governing the malignant progression of OSCC, showing the considerable possibility of circDHTKD1 as a predictive and therapeutic target for clinical diagnosis and treatment of OSCC.