凋亡抑制新基因Livin与宫颈癌的关系

凋亡蛋白抑制因子(IAP)是一类抑制凋亡的调节分子,其成员Livin是新发现的凋亡抑制基因,能够与内源IAP抑制剂SMAC和caspase-3、caspase-7、caspase-9结合,发挥抗细胞凋亡的作用.近年来,研究发现Livin在宫颈癌细胞及组织中高表达,而且通过检测癌细胞凋亡有助于确定宫颈癌的发生机制及其疗效评价,因此研究Livin结构与功能及作用机制对于宫颈癌的发生、发展、诊断与治疗有积极意义.     

siRNA特异性抑制K562细胞Livin基因表达及其诱导凋亡作用

本研究探讨小分子RNA干扰技术抑制livin基因表达对白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。设计合成livin特异性小干扰RNA(siRNA),核转染K562细胞,培养转染后的K562细胞,用RT-PCR检测livin mRNA的表达,Western blot检测Livin蛋白的表达。以未转染细胞作对照,同时转染带有增强型绿色荧光蛋白的载体作为阳性对照,用流式细胞术检测其细胞绿色荧光以确定转染效率。用膜联蛋白Ⅴ及碘化丙锭双染法检测细胞凋亡率。结果表明,电穿孔的转染效率可达50%。siRNA既可以抑制livin mRNA表达,也可以抑制livin蛋白表达。特异性siRNA转染细胞后48 h细胞凋亡率为(27.41±2.30)%,与对照组(9.63±0.89%)比较明显提高(P<0.05)。结论:SiRNA可以抑制livin基因的表达,并能抑制livin基因的抗凋亡作用。     

RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中livin基因的表达

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断结肠癌细胞系LOVO中livin基因的表达,并研究livin基因沉默后对LOVO细胞增殖和克隆形成产生的影响。方法:用真核转录载体pSilencerTM4.1-CMV neo构建针对livin基因的重组RNAi真核转录载体pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,脂质体法转染结肠癌细胞系LOVO,通过RT-PCR、免疫印迹实验检测livin的表达变化,并用克隆形成实验、MTT法检测转染后LOVO细胞在细胞增殖、克隆形成等方面的变化。结果:重组载体pSilencer4.1-L1有效地阻断了LOVO细胞中livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0.01)。pSilencer4.1-L1转染LOVO细胞后,与对照组相比细胞生长速度明显变慢,其细胞数在72h时与对照组相比减少约30%;克隆形成率仅为15%,与对照组相比下降了约70%。结论:成功构建了可有效沉默livin基因的RNAi干涉载体,初步证明livin基因在结肠癌细胞的分化增殖等方面所起的重要作用,为进一步阐明livin基因与结肠癌的关系以及以livin基因为靶点的结肠癌基因治疗研究奠定了基础。     

凋亡抑制蛋白livin在人非小细胞肺癌中的表达以及和survivin表达的关系

目的：探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织中凋亡抑制蛋白livin表达及其与各临床病理因素的关系,以及和凋亡抑制蛋白survivin表达的相关性。方法：采用免疫组织化学法检测100例NSCLC患者的病变肺组织（肺癌组）以及10例正常或肺良性疾病患者肺组织（对照组）livin蛋白和survivin蛋白的表达水平,并分析2者与肺癌的组织类型、分化程度、淋巴结转移之间的关系,以及2种蛋白表达的相关性。结果：100例NSCLC组织中livin表达阳性率为68．0％、survivin为62．0％,而在正常和癌旁组未检出阳性结果;livin的表达与组织分化和淋巴结转移有关,组织分化差,淋巴结转移者livin表达率高（P〈0．05）．62例survivin阳性样本中有38例livin呈阳性。结论：livin和survivin蛋白在癌组织中表达上调,提示其可能在非小细胞肺癌发生发展中起促进作用。survivin和淋巴结转移的密切关系表明它的高表达可能反映患者较差的预后。livin基因可能成为非小细胞肺癌治疗的一个靶基因。     

Silencing livin gene by siRNA leads to apoptosis induction, cell cycle arrest, and proliferation inhibition in malignant melanoma LiBr cells

Aim： The aim of the present study was to investigate the effects of silencing the livin gene by small interfering RNA （siRNA） on the expression of livin and the effects on apoptosis, cell cycle, and proliferation in human malignant melanoma LiBr cells. Methods： Three chemically-synthetic siRNA duplexes targeting livin were transiently transfected into the LiBr cells, and the effects on livin expression were detected both at the mRNA level by real-time RT-PCR and at the protein level by Western blotting. Apoptosis was evaluated by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated digoxigenin-dUTP nick-end labeling assay, flow cytometric analysis, and the expression of procaspase-3 and activated caspase-3 analysis by Western blotting. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. Cell proliferation was determined by 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Results： One of the 3 designed siRNA could effectively knock down the livin expression both at the mRNA and protein levels in dose- and time-dependent manners; 100 nmol/L with maximum downregulation on mRNA at 48 h, and on the protein at 72 h after transfection. Silencing livin could significantly induce apoptosis, arrest cell cycle at the Go/G1 phase, and inhibit proliferation in LiBr cells. Meanwhile, caspase-3 was activated. Conclusion： The livin gene could serve as a potential molecular target for gene therapy by siRNA for malignant melanoma.     

胃癌组织中livin与caspase-9、p53的表达及相互关系

目的 研究凋亡蛋白livin和 caspase-9、p53在胃癌组织中的表达及与胃癌生物学行为关系.方法采用免疫组化S-P检测58例胃癌组织及正常胃黏膜中livin和caspase-9、p53的蛋白表达.结果胃癌组织中 livin和caspase-9的、p53蛋白表达阳性率分别为65.5%、20.7%、58.6%,与正常胃黏膜蛋白表达阳性率(分别为3.5%、62.1%、5.2%)比较差异有统计学意义(P＜0.05);livin在组织分化差、淋巴结转移者、临床分期高表达率均增高差异有显著性(P＜0.05);livin表达与caspase-9蛋白表达呈负相关性(rs=-0.195,P＜0.05).livin与p53蛋白表达呈正相关性(rs= 0.851,P＜0.05).结论 livin和caspase-9参与胃癌的发生、发展,可能成为胃癌治疗的新分子靶点.抑癌基因p53的失活与凋亡抑制基因livin在胃癌的发生方面可能有相互促进作用.     

原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和caspase-3基因表达的影响

目的探讨原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和cospose-3基因表达的影响。方法用不同终浓度原花青素（0～600μmol／L）处理宫颈癌Hela细胞24h，采用MTT比色法分析细胞存活率，Hoechst 33258-PI荧光染色法检测凋亡，RT—PCR检测livin、cospose-3 mRNA表达变化，Western blot检测livin、cospose-3 P17蛋白表达的变化，用比色法检测caspose-3相对活性。结果随着原花青剂量的增加，宫颈癌Hela细胞存活率降低，凋亡明显增加，livin mRNA表达和蛋白表达水平逐渐减少，而cospose-3逐渐增加；随原花青素浓度从75—600μmol／L增加，caspase-3相对活性增加（P〈0．05），在600μmol／L原花青素时caspose-3相对活性达最大值。结论原花青素可剂量依赖性的减少livin mRNA和蛋白表达；原花青素可剂量依赖性的增加caspose-3 mRNA、蛋白表达和增加cospose-3活性。     

Livin在小细胞肺癌组织中的表达

目的：探讨凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族中的新成员Livin在小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）组织中的表达及其与临床病理的关系。方法：采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测SCLC组织中LivinαmRNA和LivinβmRNA的表达,并用western blot分析Livin蛋白的表达。结果：30例SCLC组织中有19例Livin表达,阳性率为63.33%,其表达与患者年龄、性别、肿瘤的TNM分期、淋巴结转移和肿瘤大小均无关（P〉0.05）。而16例癌旁正常肺组织中Livin低表达,阳性率为12.5%（P〈0.01）。结论：Livin在SCLC组织中异常表达,有望成为小细胞肺癌诊断和基因治疗的新靶点。     

RNAi沉默livin基因表达对胶质瘤U251细胞增殖的影响

目的:通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)阻断胶质瘤U251细胞中livin基因的表达,研究livin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响.方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切鉴定后,用脂质体法转染胶质瘤U251细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后胶质瘤U251细胞的凋亡变化.结果:酶切证实设计合成的DNA片段已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-liv1、pSilencer2.0-liv2重组载体均能有效地阻断胶质瘤U251细胞中livin基因的表达,使livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳.转染后的U251细胞生长速度明显变慢.转染pSilencer2.0-1iv2实验组细胞的凋亡增加了17.0%.结论:重组真核载体能有效抑制U251细胞的livin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡.