不同红色荧光蛋白在酵母细胞中的表达效果分析

目的 比较不同红色荧光蛋白基因在酵母细胞中的表达效果。 方法 利用分子生物学方法,构建了4种红色荧光蛋白(DsRed)基因酵母报告载体,分别是pGPD-DsRed、pGPD-DsRed-express-2、pGPD-yDsRed和pGPD-yDsRed-express-2,后两者含有酵母细胞偏好性的密码子,将4种DsRed酵母报告载体转入W303-1A酵母细胞,利用倒置荧光显微镜观察DsRed的表达,并用多功能酶标仪测酵母细胞的发光强度。结果 各红色荧光发光强度明显不同,其中DsRed-express-2发光最强,其次是yDsRed-express-2,yDsRed发光强度最弱。 结论 在酵母细胞中红色荧光蛋白的强度与密码子偏好性无关;定量红色荧光蛋白表达强度最好选用DsRed-express-2报告基因。     

胃癌细胞中SerpinB5与MAFbx的相互作用及其作用位点研究

目的 探讨胃癌细胞中SerpinB5能与MAFbx的相互作用及其作用位点.方法 采用酵母双杂交及免疫共沉淀方法检测SerpinB5与MAFbx之间的相互作用.分别用RNA干扰及瞬间转染pGBKT7-SerpinB5调节SerpinB5表达水平.在胃癌细胞株SUN-16中研究SerpinB5对MAFbx表达的影响.用同源建模的方法构建出MAFbx的结构信息;并以分子对接的手段来预测SerpinB5与MAFbx相互作用的位点.结果 酵母双杂交及免疫共沉淀均证实SerpinB5能与MAFbx相互作用;MAFbx的表达水平随着SerpinB5的表达水平变化而变化.同源建模和分子对接的方法预测SerpinB5与MAFbx蛋白相互作用的关键残基是PR0261、ASN361和LYS362.结论 胃癌细胞中SerpinB5能与MAFbx相互作用,且SerpinB5上的PR0261、ASN361、LYS362残基是其与MAFbx蛋白相互作用的可能位点.     

Yeast expressed classical swine fever E2 subunit vaccine candidate provides complete protection against lethal challenge infection and prevents horizontal virus transmission

Classical swine fever (CSF) caused by the classical swine fever virus (CSFV) is a highly contagious swine disease resulting in large economical losses worldwide. The viral envelope glycoprotein E(rns) and E2 are major targets for eliciting antibodies against CSFV in infected animals. A Pichia pastoris yeast expressed E2 protein (yE2) has been shown to induce a protective immune response against CSFV challenge. The purpose of this study is to determine the optimal dose of yE2 and its efficacy on the prevention of virus horizontal transmission. A yeast-expressed E(rns) (yE(rns)) protein was also included to evaluate its immunogenicity. The yE(rns) vaccinated pigs seroconverted to CSFV-E(rns)-specific antibody but no neutralizing antibody was detected and none survived after challenge infection, suggesting yE(rns) and yE2 retain correct immunogenicity but only the yE2 is able to induce a protective immune response. All three doses of yE2 (200, 300, and 400μg) could elicit high titers of neutralizing antibodies and protective responses after challenge. The yE2/200 group demonstrated a mild fever response but recovered soon, and none of the yE2/300 and yE2/400 pigs became febrile. The optimal dose of yE2 was recommended to be 300μg of the total amount of secreted proteins. In addition, the yE2 vaccine could cross-protect from all three genotypes of viruses. Further, the yE2 vaccine efficacy in preventing virus horizontal transmission was evaluated by cohabitation of unimmunized sentinels 3 days after challenge infection. All the sentinel pigs were alive and had no clinical symptoms confirming yE2 vaccine could confer a protective immune response and prevent horizontal transmission of CSFV.     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功.     

CARP编码蛋白的相互作用蛋白筛选

目的 :筛选与CARP编码蛋白相互作用的蛋白 ,为其功能研究奠定基础。方法 :将编码全长CARP的DNA序列插入到pGBKT7 BD载体中 ,转化AH1 0 9酵母 ,然后与含有已克隆到pACT2载体上的人心脏cDNA文库的Y1 87酵母融合。CARP与相应的人心脏cDNA片段编码的蛋白发生相互作用后 ,可激活报告基因的表达。阳性克隆的质粒进行测序分析。同源性检索搜寻GenBank中与之相同或相似的序列。结果 :共筛选约 3× 1 0 7个cDNA ,筛选出 9个阳性克隆 ,其中包括FLNa (actin bindingprotein 2 80 )。结论 :CARP编码蛋白在酵母中可以特异性的结合FLNa ,提示CARP可能通过与FLNa相互作用参与调控细胞增殖     

秦绵祛风胶囊对鹌鹑高尿酸血症模型的治疗作用

目的观察秦绵祛风胶囊对鹌鹑高尿酸血症的影响。方法通过喂饲用酵母配制的造模饲料造成鹌鹑高尿酸血症模型,设秦绵祛风胶囊高、中、低3个剂量组并以苯溴马隆为阳性对照,在造模的同时连续灌胃药35d,检测血中黄嘌呤氧化酶、尿酸、血尿素氮和三酰甘油及粪便中尿酸含量。结果模型动物血清中黄嘌呤氧化酶、尿酸和三酰甘油水平及粪便中尿酸含量较正常对照组明显升高。秦绵祛风胶囊各剂量组均可显著降低鹌鹑血清中的尿酸和三酰甘油水平,同时升高粪便中尿酸含量,对血清中黄嘌呤氧化酶活性影响不大。结论秦绵祛风胶囊具有降脂降尿酸的功能,其机制可能是通过提高动物排泄尿酸的能力,从而降低血中尿酸的含量。     

Mutations in the yeast fructose 1,6-biphosphatase structural gene affect expression of a fructose 1,6-biphosphatase-endoglucanase A hybrid protein

Mutations in the yeast fructose 1,6 biphosphatase structural gene severely reduced expression of a fructose 1,6 biphosphatase-endoglucanase A hybrid protein introduced into yeast on multicopy or centromeric vectors. Upon glucose limitation the mutant yeasts were incapable of de-repressing endoglucanase A synthesis.     

应用酵母双杂交系统筛选新基因AngRem104相关蛋白

目的：应用酵母双杂交系统筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白，为该基因的功能研究提供线索。方法：构建AngRem104的真核表达载体AngRem104-pGBKT7／c—myc，转化酵母菌AH109，Western blot证实蛋白表达，进行毒性和自激活检验，与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合，筛选与AngRem104相互作用的蛋白。结果：AngRem104蛋白能在酵母中正常表达，对酵母细胞无毒性，不存在自激活现象。筛选出的蛋白包括真核翻译延伸因子1α1、糖皮质激素受体AF-1特异延伸因子、β2-微球蛋白、巴戴-比德尔综合征2蛋白及4个与细胞代谢有关的蛋白。结论：AngRem104可能影响细胞内某些转录因子活性和细胞代谢，并与某些免疫相关疾病和遗传病发病有关。酵母双杂交结果为AngRem104的功能研究提供了重要线索。     

真核表达系统的研究进展

真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系 ,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。基因工程中常用的真核表达系统有 :酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统。甲醇酵母主要利用醇氧化酶的基因启动子在甲醇诱导下表达外源蛋白 ,而三磷酸甘油脱氢酶启动不需甲醇诱导 ,可缩短到达峰值表达的时间。杆状病毒是昆虫细胞表达系统中最常用的表达载体 ,利用转座原理构建重组杆状病毒是一种有效的构建重组体的方法 ;杆状病毒 S2 系统是最近构建的一种不裂解宿主细胞的新型昆虫细胞表达系统。哺乳动物细胞表达系统中 ,腺病毒是常用的表达载体 ,通过细菌内同源重组和Cre/loxp系统构建重组体 ,可提高重组效率 ;利用杆状病毒将外源基因导入哺乳动物细胞 ,不会引起病毒基因的表达 ;四环素诱导表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统 ,该系统具有严密、高效、可控性强的特点     

微生物转化生产木糖醇中工业化原料培养基组成的优化

对用酵母转化木糖醇中工业化原料培养基组成的优化进行了较系统的研究，研究中采用了Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ［１］和响应曲面法，得到了一个完全用工业化原料组成的优化培养基，摇瓶转化率最高达８０．４％。实验结果表明，在保持较高转化率的前提下，发酵培养基可以采用较廉价的工业化原料。