Construction of Human ScFv Phage Display Library against Ovarian Tumor

In order to construct a single chain fragment variable (ScFv) phage display library against ovarian tumor, by using RT-PCR, the human heavy chain variable region genes (VH) and light chain variable region genes (VL) were amplified from lymphocytes of ovarian tumor patients and subsequently assembled into ScFv genes by SOE. The resulting ScFv genes were electrotransformed into E. coli TG1 and amplified with the co-infection of helper phage M13KO7 to obtain phage display library. The capacity and titer of the resulting library were detected. The phage antibody library with a capacity of approximately 3×109cfu/μg was obtained. After amplification with helper phage, the titer of antibody library reached 5×1012cfu/mL. Human ScFv library against ovarian tumor was constructed successfully, which laid a foundation for the screening of ovarian tumor specific ScFv for the radioimmunoimaging diagnosis of ovarian tumor.     

Immunotoxins and cancer therapy

In the past decade,an increased amount of clinicallyloriented research involving immunotoxins has been published.Immunotoxins are a group of artificially-made cytotoxic molecules targeting cancer cells.These moleculescomposed of a targeting moiety,such as a ligand or an antibody,linked to toxin moiety,which is a toxin with eithertruncated or deleted cell-binding domain that prevents it from binding to normal cells.Immunotoxins can bedivided into two categories:chemically conjugated immunotoxins and recombinant ones.The immunotoxins of thefirst category have shown limited efficacy in clinical trials in patients with hematologic malignancies and solidtumors.Within the last few years,single-chain immunotoxins provide enhanced therapeutic efficacy overconjugated forms and result in improved antitumor activity.In this review,we briefly illustrate the design of theimmunotoxins and their applications in clinical trials.Cellular & Molecular Immunology.2005;2(2):106-112.     

抗人CD3单链抗体基因的构建及序列分析

本文在已克隆抗人ＣＤ３抗体ＶＨ和ＶＫ基因的基础上，设计并合成了ＰＣＲ引物。两个外侧引物分别含有ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ酶切位点及起始码和终止码序列，４个内侧引物各含部分连肽基因序列，回收后混合退火。     

HBV Pre S2 3B9单抗轻、重链可变区基因的分离,序列分析及单链可变区抗体基因的构建

3B9(杂交瘤细胞)是一株分泌HBV Pre S2抗原的单抗细胞,为从分子水平分析、了解3B9株进而为制备新一代基因工程抗体奠定基础,用分子生物学技术,提取3B9杂交瘤细胞总RNA,经反转录、PCR分离获得了3B9单抗的轻、重链可变区基因,并利用PCR及双脱氧核苷酸链末端终止法对3B9单抗的可变区基因的核苷酸序列进行了分析。结果表明,3B9单抗轻链隶属小鼠Ig Kappa轻链第Ⅱ亚组,JK_1基因重排;而3B9单抗重链隶属小鼠Ⅰg重链第Ⅱc亚组。在此基础上,作者用一编码疏水性多肽接头的DNA片断将3B9单抗轻、重链可变区基因连接,成功地构建了3B9单抗单链可变区抗体基因。为下一步克隆、表达有抗原结合活性的单链抗体打下了良好的物质基础。     

抗Pgp基因工程抗体ScFv的构建、表达及其活性测定

目的：构建表达抗PgpScFv，进行体外活性的测定。方法：利用RT-PCR方法，克隆抗Pgp杂交瘤细胞PHMAO2的重链可变区基因(VH)，轻链可变区基因(VL)，拼接为单链抗体(ScFv)，再克隆到具有强启动子的PET28a( )载体上进行表达，并进行了表达产物体外活性的测定。结果：构建了表达质粒PET28a( )．ScFvPGP，表达产物可与表达Pgp抗原的K562／A02细胞特异性结合，并不抑制Pgp外排泵的功能。结论：构建表达的抗PgpScFv只有针对Pgp抗原的识别功能，并无抑制作用，因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能，无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂，均具有广泛的应用前景。     

抗KGla细胞噬菌体展示ScFv的筛选及鉴定

目的 应用ＫＧ１ａ细胞（髓系白血病细胞系）筛选噬菌体抗体库,获得能以一定特异性结合ＫＧ１ａ细胞的单链抗体（ＳｃＦｖ）,克隆重其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法 用完整的ＫＧ１ａ细胞筛选一个经ＫＧ１ａ细胞免疫小鼠脾细胞的ＳｃＦｖ噬菌体抗体库,重复筛选４轮;细胞ＥＬＩＳＡ鉴定了其中９６个克隆重与ＫＧ１ａ细胞的结合反应;从２６个ＫＧ１ａ细胞ＥＬＩＳＡ阳性克隆中挑选了３个克隆重,进一步用免疫     

小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体的表达与纯化

目的：表达并纯化小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体,并初步分析比较两者的体外生物活性。方法;经ＤＮＡ重组的构建重组表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中高表达两种单链抗体,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体后经ＩＭＡＣ纯化表达产物,并用凝血酶切除Ｎ端融合的（Ｈｉｓ）６,纯化的表达产物经复性后ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果：两种单链抗体在大肠杆菌中表达量占全菌蛋白的５０％以上,经变性,纯化后纯度可达９７％     

抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达

目的　构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法　用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PCR方法将 VH和 VL拼接在一起 ,构建抗人 AFP单链抗体的基因。将 Sc Fv基因克隆至 p GEM- T载体构建 ,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 Sc Fv基因连接到 p ET32 (a )质粒 ,转化 BL - 2 1(DE3)细菌。抗性生长的克隆用异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导 4 h。溶解细菌并纯化 Sc Fv,通过 SDS-PAGE电泳及竞争抑制 EL ISA实验检测其活性。结果　获得的 VH含 339bp,来自小鼠 Ig Gγ链 ,VL含 312 bp,来自小鼠κ链。 VH和 VL通过编码 (G4 S) 3连接肽的 4 5 bp序列连接在一起构成含 6 96 bp的 Sc Fv基因。 BL - 2 1(DE3)中表达的 Sc Fv抗体与融合蛋白 (Trx A)融合在一起并以包涵体的形式存在。 Trx A- Sc Fv相对分子质量约 4 0× 10 3,Sc Fv相对分子质量约 2 4× 10 3。竞争 EL ISA实验显示 :Trx A - Sc Fv可抑制 4 1%的 Mc Ab与抗原结合 ,而Sc Fv抗体则可抑制 5 3%的 Mc Ab与抗原结合。结论　我们成功构建了由 6 96个碱基组成的抗人 AFP单链抗体的基因 ,并在大肠杆菌获得了     

SLE患者自身抗体单链噬菌体抗体库构建及抗体活性检测

本文用ＳＬＥ病人外周血淋巴细胞抽提ＲＮＡ,采用ＲＴ ＰＣＲ反应以人的特异性ＨｕＶＨＢＡＣＫ、ＨｕＪＨＦＯＲ和ＨｕＶＬＢＡＣＫ、ＨｕＶＬＦＯＲ引物扩增人抗体的ＶＨ和ＶＬ基因片段,并将其与ｌｉｎｋｅｒ拼接成ＳｃＦｖ片段克隆于大肠杆菌,使其与噬菌体基因Ⅲ的产物以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达,从而构建了ＳＬＥ病人的单链噬菌体抗体库,ＥＬＩＳＡ检测证明ＳｃＦｖ基因产物具有抗体活性。ＳＬＥ噬菌体抗体库的构建为ＳＬＥ发病机理、诊断和治疗研究打下了良好的基础。     

抗日本血吸虫循环抗原单链抗体的抗原定位和初步应用

目的　将获得的抗日本血吸虫循环抗原的单链抗体进行抗原定位和用于诊断。方法　用间接荧光抗体试验(IFA)对 2株可溶性单链抗体所针对的抗原进行定位 ;将可溶性单链抗体进行生物素标记后 ,用于检测急、慢性血吸虫病人血清标本。结果　两个特异性单链抗体分别于日本血吸虫成虫的肠管和生殖系统呈现明显的荧光反应。检测急性血吸虫病人血样 2 0份 ,慢性血吸虫病人血样 30份 ,正常人血样 2 0份。结果用其中 1株单链抗体检测急性病人的敏感度为 6 0 % ,慢性病人的敏感度为 36 7% ,特异度为 90 % ;以 2株单链抗体混合检测急性病人的敏感度为 75 % ,慢性病人的敏感度为 5 6 7% ,特异度为 85 %。结论　经抗体库技术制备的单链抗体可用作日本血吸虫病的诊断 ,单抗组合较单株单抗可提高免疫学检测的敏感性。