利用噬菌体表面呈现技术制备HIV-1整合酶单链抗体的初步研究

目的：研制ＨＩＶ－１整合酶（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ，ＩＮ）的重组噬菌体单链抗体。方法：采用噬菌体表面呈现方法。结果：由ＩＮ蛋白免疫的小鼠脾细胞ｍＲＮＡ中构建了单链抗体基因ｃＤＮＡ文库，克隆入噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ，经转化大肠杆菌ＴＧ１，获得了库容为３．５×１０５的表达文库。利用包被在酶联板上的ＩＮ蛋白进行四轮亲和富集，筛选出７６株具有ＩＮ结合活性的重组噬菌体。对随机挑选的一株克隆进行了ＤＮＡ序列分析，证明其符合小鼠抗体序列。结论：获得了抗ＨＩＶ－１ＩＮ的噬菌体单链抗体，为其进一步研究打下基础。     

癌胚抗原单链抗体—链亲和素融合蛋白的功能鉴定

目的：用ｐＥＴ２１原核表达系统表达癌胚抗原单链抗体－链亲和素融合蛋白。方法：融合表达载体转化大肠杆菌菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）,用１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导表达,表达产物行亲和印迹及免疫斑点分析。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明,融合蛋白分子质量约５７ｋｕ,亲和印迹及免疫斑点证实融合蛋白具有结合ＣＥＡ与生物素的双特异性。结论：原核表达系统可以表达具有双特异性的融合蛋白,该融合蛋白利用生物素标记的辣根过     

Cell surface expression of single chain antibodies with applications to imaging of gene expression in vivo

Imaging of gene expression in vivo has many potential uses for biomedical research and drug discovery, ranging from the study of gene regulation and cancer to the non-invasive assessment of gene therapies. To streamline the development of imaging marker gene technologies for nuclear medicine, we propose a new approach to the design of reporter/probe pairs wherein the reporter is a cell surface-expressed single chain antibody variable fragment that has been raised against a low molecular weight imaging probe with optimized pharmacokinetic properties. Proof of concept of the approach was achieved using a single chain antibody variable fragment that binds with high affinity to fluorescein and an imaging probe consisting of fluorescein isothiocyanate coupled to the chelator diethylene triamine penta-acetic acid labeled with the gamma-emitter ¹¹¹In. We demonstrate specific high-affinity binding of this probe to the cell surface-expressed reporter in vitro and assess the in vivo biodistribution of the probe both in wild-type mice and in mice harboring tumor xenografts expressing the reporter. Specific uptake of the probe by, and in vivo imaging of, tumors expressing the reporter are shown. Since ScFvs with high affinities can be raised to almost any protein or small molecule, the proposed methodology may offer a new flexibility in the design of imaging tracer/reporter pairs wherein both probe pharmacokinetics and binding affinities can be readily optimized.     

HIV多抗原位点同源序列合成基因的表达及活性鉴定

目的：在原核表达载体系统中对HIV-1gp41/gp120和HIV-2gp125/gp36外膜蛋白多个抗原位点同源序列合成基因进行表达、纯化并鉴定其活性。方法：人工合成含HIV-1gp41的3个抗原位点、HIV-1gp120的2个抗原位点、HIV-2gp125的3个抗原位点和HIV-2gp36的1个抗原位点的串联基因，克隆到原核表达载体pRSETB中，构建重组表达质粒pRSETB-env，用异丙-β-Ｄ-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达，采用金属离子亲和层析技术纯化表达蛋白，逐渐降低尿素浓度使目的蛋白复性，免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定。结果：目的基因在BL21中有较高表达率，纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见相对分子质量约44 000的蛋白带，与设计相对分子质量相符。免疫印迹、ELISA试验显示pRSETB-env质粒的HIV-1/2表达蛋白与HIV-1及HIV-2患者血清都能较好地结合，与其他患者血清无交叉反应。结论：成功构建了由HIV-1/2外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env，并在原核细胞中高效表达，表达蛋白经纯化后纯度较高,并具有良好特异性和活性。     

抗人CD80单链抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人CD80单链抗体(ScFv),并初步研究其生物学功能。方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80mAb的杂交瘤细胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压筛选。纯化抗CD80-ScFv,并分析其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗CD80-ScFv对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。结果:构建的抗CD80-ScFv基因全长为828 bp,经测序含有信号肽和连接肽。实验获得稳定表达细胞株SA-Ⅱ,其培养上清与L929-CD80细胞的阳性结合率达98%以上。抗体纯化后产率约为15.12 mg/L,其能够识别Raji和Daudi细胞天然表达的CD80分子,结合率分别为96.6%和95.0%。抗CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。结论:成功建立了抗CD80-ScFv CHO细胞的表达株(命名为SA-Ⅱ),该抗体能够特异识别细胞表面膜型CD80分子并介导相应的生物学功能。     

Humanization of high affinity anti-HBs antibody by using human consensus sequence and modification of selected minimal positional template and packing residues

We had earlier reported the construction and characterization of a high affinity recombinant scFv generated from a potential neutralizing mouse monoclonal antibody against the Hepatitis B surface antigen. In this report we describe the humanization of this scFv by grafting its antigen binding site onto framework of the human consensus sequence of highest similarity. We have used molecular modeling to alter not only the clearly permissible residues but also several minimal positional template and V_H/V_L interface residues. The humanized scFv retains the binding characteristic of the mouse monoclonal even under conditions that usually destabilize antigen antibody interactions. This high affinity humanized scFv provides a basis for the development of prophylactic/therapeutic molecules.     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛（Dig）人单链抗体（ADA ScFv），为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体。方法：①以改良法制备Dig-BSA偶联物②以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选，通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性，通过ELIS竞争抑制实验分析其特异性，对阳性克隆的DNA进行测序分析。结果：①在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集；②获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆；③阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群。结论：利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADA ScFv，经过一步分析及抗体工程改造后，有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

抗人TNF-α单链抗体rScFvH22原核表达及纯化

目的：应用PET32-c原核表达载体快速、高效地表达及纯化单链抗体。方法：将单链抗体H22基因克隆到PET32-c原核表达载体中，通过酶切及测序鉴定正确后，进行原核诱导表达和纯化。并检测纯化后单链抗体的功能。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳表明，单链抗体基因克隆成功；SDS-PAGE结果表明，单链抗体得到成功表达和纯化；ELISA和Western印迹结果表明，单链抗体H22能够特异性结合人TNF-α。结论：成功地表达及纯化抗人TNF-α单链抗体rSeFvH22。     

错配PCR致突变的实验条件研究

目的：对目前常用的致突菌株和PCR随机突变方法进行评价。方法：用单链抗体表达质粒转化致突菌株XL1-Red，转种传代7d，选取克隆测定DNA序列。用错配PCR在相同基因中引入突变，比较不同Mg^2 浓度、不同dNTP的浓度、不同dITP等条件下所致突变率。结果：在XL1－Red菌株中转种7d（约50代）后，测定突变率＜0.1%。在错配PCR中，增加Mg^2 浓度可提高突变率，增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果。在dITP配以低浓度的dATP或dGTP时突变率较低，使用5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L MnCl2、1mmol/L dTTP和dCTP的条件下，经2轮PCR（共60个循环）突变率可＞2％。其突变类型有明显偏向性，以A／T的突变为主，转移多于颠换。结论：用致突菌株引入的突变率过低，不适用于抗体亲和力成熟，错配PCR在合适条件下可达到2％以上突变率，适用于随机突变抗体库的构建，但其突变类型有偏向性，应予以考虑。