新型人骨形成蛋白2逆转录病毒载体的构建及活性检测

目的 构建表达重组人骨形成蛋白2(BMP2)基因的重组逆转录病毒,对其在成骨细胞中的生物学作用进行探讨.方法 克隆BMP2基因,与pDNR-CMV连接构成pDNR-CMV-BMP2,然后将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和逆转录病毒质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染包装细胞PT67进行病毒包装,NIH3T3细胞测定病毒滴度;将逆转录病毒感染人成骨细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长变化,Western blot检测BMP2蛋白表达.结果 重组逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2经鉴定连接正确;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,上清液中病毒滴度可达到5×108pfu;MTT检测见逆转录病毒组与对照组比,48和72h细胞抑制率(5.1%比5.3%,8.5%比8.3%)差异无统计学意义(P>0.05),转染48 h后Westernblot可见BMP2蛋白高表达.结论 成功构建了BMP2逆转录病毒,为BMP2基因治疗及其功能研究提供了有效的手段.     

运动与骨组织保健研究进展

适度运动能提高骨峰值,增加骨密度,延缓机体衰老。超负荷运动的竞技型职业运动员在竞技状态中,长期的高强度运动使骨组织承受超负荷压力与非正常劳损;在退役之后,这一人群都出现不同程度的骨组织伤痛与骨质疏松症。根据现代骨组织代谢平衡与骨质疏松分子机理,科学保护竞技运动员的骨组织健康,减少劳损,防治骨质疏松对于大力发展祖国的体育事业,增强人体健康具有重要意义。     

含枸杞多糖血清对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化的影响

目的研究含枸杞多糖血清对MC3T3-E1成骨细胞细胞增殖、分化和矿化的影响。方法含枸杞多糖血清分别加入MC3T3-E1成骨细胞培养液中,使其终浓度为5%、10%、20%3种体积浓度,通过MTT法,碱性磷酸酶活性测定,骨钙素检测和Von kossa矿化染色法观察含枸杞多糖血清的促细胞增殖、分化、矿化作用。结果含枸杞多糖血清在5%、10%浓度促进MC3T3-E1成骨细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05);10%、20%浓度提高MC3T3-E1成骨细胞内碱性磷酸酶的活性,差异有统计学意义(P<0.01)。含枸杞多糖血清在20%浓度培养7及11 d时能明显促进MC3T3-E1成骨细胞骨钙素合成和分泌,20%浓度培养18 d时MC3T3-E1成骨细胞的矿化结节数目增多,差异有统计学意义(P<0.01)。结论含枸杞多糖血清可以促进MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化能力。     

破骨细胞释放凋亡小体微小RNA-30a对成骨活性的影响

目的 探讨破骨细胞凋亡释放凋亡小体介导成骨活性的作用.方法 通过小鼠(n=10)骨髓单核细胞体外诱导破骨细胞,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和细胞骨架F-actin与DAPI双标免疫荧光鉴定破骨细胞,破骨细胞与小鼠成骨细胞MC-3T3E1共培养体系,DNA片段化ELISA分析破骨细胞凋亡,凋亡小体标志物检测,骨形...     

辛伐他汀对成骨细胞增殖和矿化功能影响的实验研究

目的：研究辛伐他汀对原代培养大鼠颅骨成骨细胞增殖和矿化功能的影响。方法:酶消化法分离培养大鼠颅骨成骨细胞,分别用空白培养基、不同浓度辛伐他汀及不同浓度的rhBMP-2作用24h后,MTT法测量药物对细胞增殖活性的影响,细胞接种到培养板连续培养7d,von Kossa染色观察成骨细胞矿化结节,采集图像并转换处理后计算矿化结节面积的百分比。结果:辛伐他汀对成骨细胞增殖活力的增加呈剂量依赖方式,而且可使成骨细胞矿化面积百分比显著增加,与rhBMP-2的作用相当。结论:辛伐他汀可促进体外培养大鼠颅骨成骨细胞的增殖和矿化,从而发挥促进骨形成的作用。     

脂联素调控人成骨细胞OPG/RANKL表达的信号转导机制

目的 研究脂联素调控人成骨细胞护骨素(OPG)和NF-кB受体活化凶子配体(RANKL)表达的作用机制.方法 人成骨细胞OPG和RANKL mRNA的表达以实时PCR检测,p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(JNK)的磷酸化水平用Western印迹法检测.廊用小分子RNA干扰技术(siRNA)阻断脂联素受体(AdR)表达,并以p38 MAPK抑制剂(SB203580)和JNK抑制剂(SP600125)干预,以观察脂联素对人成骨细胞OPG/RANKL作用的调节机制.结果 用siRNA沉默AdRl的表达可消除脂联素促进人成骨细胞RANKL表达和抑制OPG表达的作用;脂联素干预前予SB203580阻断p38 MAPK后,也可消除脂联素对成骨细胞RANKL和OPG的作用,而SP600125并无作用.结论 在人成骨细胞中,脂联素通过AdR1/p38 MARK途径促进RANKL表达和抑制OPG的表达.     

胚胎干细胞诱导的内皮细胞对自身向成骨细胞分化的影响

目的探讨由胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）诱导的内皮细胞（endothelial cells,Ec）与自体胚胎干细胞联合培养时对ESCs成骨作用的影响。方法提取小鼠的胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞,诱导胚胎干细胞生成Ec,培养细胞分为四组。A组：胚胎干细胞诱导组;B组：胚胎干细胞诱导组;C组：胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞（Ec）诱导组;D组：ESCs和诱导的EC联合培养诱导组。通过干细胞形态的观察、免疫荧光、细胞的增值、碱性磷酸酶以及骨钙素含量的测定从酶学、组织学及生化学等不同方面观测骨髓基质细胞对胚胎干细胞向成骨细胞诱导转化的影响。结果通过细胞免疫荧光染色证实C组培养诱导的细胞为EC。D组ESCs和诱导的Ec联合培养组MTT检测结果各组细胞生长差异没有显著意义（p〉0.05）,骨钙素和碱性磷酸酶测定D组有明显差异高于其他3组（p〈0.05）。结论以胚胎干细胞诱导生成的内皮细胞对胚胎干细胞的成骨有明显的促进作用。     

b-FGF、IGF-Ⅱ、TGF-β影响兔成骨细胞体外增殖的实验研究

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）和转化生长因子－β（TGF-β）单独及交互联合作用，对兔成骨细胞体外增殖的剂量效应及时间效应。方法：采用细胞培养技术及噻唑蓝比色法，观察3种生长因子对兔成骨细胞体外增殖的调节作用。结果：b-FGF和IGF-Ⅱ在0.1-10.0ng/ml浓度范围内与兔成骨细胞增殖呈剂量效应关系。TGF-β在低浓度（0.01ng/ml）时可促进兔成骨细胞的增殖，随着浓度的增加，促增殖作用明显减弱，5d后，生长因子促进兔成骨细胞体外增殖作用达到最大。3种生长因子联合应用效果叠加。结论：3种生长因子均能促进兔骨髓来源成骨细胞的体外增殖，其作用有剂量依赖性和时间依赖性。提示探索最佳生长因子组合可有效促进成骨细胞增殖。     

骨髓基质干细胞接种于纤维蛋白凝胶的体外培养

目的：研究经分离培养的免音舱基质子细胞(MSC)接种在可吸收性纤维蛋白凝胶上向成分细胞分化，表型维持的影响。方法：取兔骨髓基质子细胞于含100nl/L胎牛血清的DMEM培养液中培养，并向成管细胞诱导。将细胞与纤维蛋白凝胶复合，通过扫描电镜观察细胞附着情况，共聚焦显微镜观察I型胶原的分泌，组织化学染色检测碱性磷酸酶(ALP)阳性细胞，ALP含量测定。结果：骨髓基质子细胞在可吸收性纤维蛋白凝胶表面附着良好并继续增殖，可分泌I型胶原，这些细胞的ALP染色呈强阳性，细胞碱性磷酸酶含量增高。结论：具有良好的可塑性、低抗原性、好的降解吸收性的纤维蛋白凝胶具有促进骨髓基质细胞表达成管细胞表型、合成细胞外基质的功能，是良好的细胞载体。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.