大鼠足细胞的原代培养及其Nephrin的特异表达

目的 建立简便的大鼠足细胞原代培养体系,检测其去氧肾上腺素(Nephrin) mRNA及蛋白的表达水平.方法 无菌取肾,分离肾皮质,胶原酶消化法分离肾小球,培养9～10d,胰蛋白酶差异消化法传代,过筛去除肾小球继续培养5～7 d:形态学观察和间接免疫荧光法进行足细胞鉴定;流式细胞仪分析足细胞纯度;实时定量PCR(qRT-PCR)、间接免疫荧光法和Western blot法比较前三代足细胞中Nephrin mRNA及蛋白的表达水平.结果 接种5d后大部分肾小球贴壁,肾小球周围有细胞爬出,其最外缘有树枝状细胞分布,形态学及特异性抗体Nephrin、WT-1鉴定为足细胞;流式细胞仪分析足细胞纯度为94.7％;间接免疫荧光和qRT-PCR均显示:与第二、三代足细胞相比,第一代足细胞中Nephrin mRNA和蛋白表达均较高(均P＜0.05);Western blot示体外培养大鼠足细胞表达两种分子量的Nephrin,且第一代足细胞Nephrin灰度值高于第二、三代足细胞(P＜0.05).结论 酶消化法结合差异过筛法接种可促进肾小球贴壁,有利于培养纯度高的足细胞;大鼠足细胞体外培养条件下能特异性表达Nephrin结构及功能蛋白.     

糖尿病大鼠肾组织Nephrin mRNA与Podocin mRNA表达的研究

目的观察糖尿病大鼠肾组织中nephrinmRNA、podocinmRNA蛋白表达与分布，探讨nephrin和podocin分子在糖尿病肾病蛋白尿中的可能作用。方法采用健康雄性Sprague—Dawley大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组，第4、8周任取6只大鼠，收集血、尿标本测定生化指标。大鼠肾组织分别作组织学、超微结构、应用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）观察nephrinmRNA、podocinmRNA在肾组织中的表达。结果在4周、8周，糖尿病组血糖、肌酐清除率、尿白蛋白排泄率较正常对照组均有不同程度的升高。糖尿病组大鼠肾组织nephrinmRNA和podocinmRNA和蛋白表达较正常对照组明显降低。尿白蛋白排泄率与nephrin、podocin表达量呈负相关，nephrin与podocin表达量呈正相关。结论糖尿病大鼠肾小球上皮细胞足突nephrin、podocin蛋白表达的减少可能是糖尿病肾病蛋白尿发生的机制之一。     

Nephrin在糖尿病肾病中的表达及意义

糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病（DM）严重并发症之一,是DM病人死亡的主要原因。据美国糖尿病协会统计,DN已成为欧美等国家致终末期肾病的最主要原因,而蛋白尿是DN早期临床标志,蛋白尿的发生主要取决于肾小球滤过功能。     

厄贝沙坦对糖尿病大鼠肾脏足细胞保护作用的研究

目的探讨厄贝沙坦对糖尿病大鼠尿蛋白以及足细胞、足突顶膜区主要的带负电荷跨膜蛋白Podocalyxin的影响。方法采用链脲佐菌素(streptozotocin STZ,65mg/kg)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型。将30只雄性SD大鼠随机分为3组:正常组、糖尿病模型组和厄贝沙坦(ARB)治疗组。连续监测血糖8周,8周后处死各组大鼠的前一天行24小时尿蛋白定量和肾功检查了肾组织;处死大鼠后取行苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin stain,HE)观察其病理变化;透射电镜观察足细胞、裂孔隔膜等变化。采用Western蛋白印迹从蛋白水平观察nephrin蛋白水平的表达。结果模型组大鼠镜下见肾小球体积增大,基底膜增厚(P<0.05)及系膜物质增多,足细胞与正常对照组比较明显减少(P<0.01),肾小球内可见散在炎细胞浸润。部分毛细血管腔受压变窄,部分肾小管上皮细胞胞浆疏松,轻度水肿。治疗组与模型组分别比较,肾小球基底膜未见明显增宽,足细胞数明显增加(P<0.05)。模型组大鼠血糖、24h尿蛋白、血肌酐水平明显升高,与对照组相比差异显著(P<0.05)。治疗组与模型组相比,上述生化指标均有所改善(P<0.05)。West-ern蛋白印迹结果表明,与正常组相比,模型组nephrin蛋白水平明显下降,经过厄贝沙坦干预后nephrin表达明显上调。结论厄贝沙坦能改善糖尿病肾病大鼠足细胞及肾脏的病理损害,显著减少糖尿病大鼠24h尿蛋白,上调nephrin的表达,具有一定的肾保护作用。     

1，25-二羟维生素D3对糖尿病肾病患者尿足细胞相关蛋白Nephrin的影响

目的：探讨1,25-二羟维生素D3（1,25-（OH）2D3）对糖尿病肾病（DN）患者尿足细胞相关蛋白Nephrin的影响。方法选取DN患者共40例,根据尿清蛋白排泄率（UAER）水平分为微量清蛋白尿的DN1组22例和大量清蛋白尿的DN2组18例,经6周洗脱期后给予1,25-（O H ）2 D30．25μg/d ,共治疗12周,10例健康体检者为对照组,测定各组人群血钙（Ca2＋）、血磷（P3＋）、血肌酐（Scr）及24 h尿蛋白及VAER ,采用定量酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组观察人群尿液中Nephrin的表达。结果DN组患者尿中Nephrin表达明显多于对照组,DN1组与DN2组间尿中Nephrin表达也存在差异,1,25-（OH）2D3可使DN1组患者尿中Nephrin表达基线下移（P＜0．05）,但对DN2组患者尿中Nephrin表达无明显影响（P＞0．05）。结论尿中Nephrin的表达是预测DN进展的有效因子,1,25-（OH）2D3可减少早期DN患者尿中Nephrin表达从而减少蛋白尿,延缓DN进展。     

乙肝病毒相关性膜性肾病足细胞Nephrin表达的改变

目的：观察乙型肝炎病毒相关性膜性肾病（hepatitis B virus associated membranous nephropathy，HBV—MN）肾小球足细胞Nephrin的表达，以探讨其发病意义。方法：经肾活检病理检查确诊的HBV—MN患者8例及原发性膜性肾病（IMN）患者5例，采用间接免疫荧光激光共聚焦显微镜观察足细胞Nephrin表达的变化。结果：HBV—MN组肾小球内Nephrin荧光强度较IMN组明显减弱，且部分节段有缺失。结论：肾小球足细胞裂孔膜蛋白Nephrin表达降低可能在HBV—MN发病中起一定的作用。     

蛋白尿慢性肾纤维化大鼠肾组织Nephrin蛋白表达动态变化

目的检测蛋白尿多柔比星肾损伤大鼠足细胞相对数目及Nephrin的表达变化,探讨Nephrin表达变化在蛋白尿发生发展中的意义。方法 36只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=16)和模型组(n=20),应用多柔比星(4 mg/kg)尾静脉注射、一周末后重复的方法建立大鼠蛋白尿慢性肾纤维化模型,于第1次注射多柔比星后4、7、10、13周末收集标本,观察大鼠24 h尿蛋白、血生化指标等,光镜、电镜观察肾组织的病理改变,Western blot检测大鼠肾皮质中Nephrin蛋白的表达,免疫组化观察Wilm肿瘤蛋白1(WT1)表达。结果①第4周末开始,模型组大鼠蛋白尿显著高于对照组(P<0.01)。②肾脏病理在第7周末时出现局灶肾小球硬化,第13周末肾小球呈明显硬化表现,第10周末见足细胞脱离基底膜。③肾皮质WTl蛋白的表达量逐渐减少,但肾脏Nephrin蛋白表达4周末时较对照组增加(P<0.01),7周末后逐渐降低。结论足细胞相对密度及相对数量的减少可能是蛋白尿发生、发展的重要因素,病程中Nephrin蛋白表达量呈先升后降的变化趋势,疾病早期其表达增加可能是足细胞抵抗损伤的一种代偿反应。     

血管紧张素Ⅱ对足细胞nephrin 磷酸化水平的影响

目的 通过建立血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)输注大鼠模型及体外足细胞培养,观察AngⅡ刺激对足细胞nephrin磷酸化水平的影响.方法 30只SPF级Wistar大鼠皮下埋置渗透性微泵,随机分为AngⅡ组(AngⅡ400 ng· kg-1·min-1,n=12)、替米沙坦(Tel)组(AngⅡ+Tel 3 mg· kg-1·d-1,n=12)和正常对照组(生理盐水代替AngⅡ,n=6),于实验0、7、14、21、28 d测量大鼠尾动脉收缩压,收集24 h尿液,检测尿白蛋白.分别在14、28 d处死动物,收集血液标本,检测血肌酐;收集肾脏标本,透射电镜观察肾小球足细胞形态,放免法检测血浆及肾组织AngⅡ水平;Western印迹检测nephrin表达及其磷酸化水平.体外培养小鼠永生化足细胞,AngⅡ (10-6 mol/L)刺激不同时间,并行洛沙坦(10-5 mol/L)干预,Western印迹法检测足细胞nephrin 表达及其磷酸化水平.异硫氰酸荧光素( FITC)-鬼笔毒环肽(phalloidin)染色标记足细胞F-actin,用外周F-actin环评分系统(CFS)半定量分析足细胞骨架运动.结果 (1)与正常对照组同时间点相比,AngⅡ组大鼠自7d起尾动脉收缩压开始升高(P＜0.05),随着作用时间的延长,血压持续升高.AngⅡ输注7d大鼠开始出现蛋白尿,并持续增加.各组大鼠血肌酐、尿肌酐及内生肌酐清除率无明显变化.AngⅡ输注大鼠血浆及肾组织AngⅡ浓度明显增高(均P＜0.05).(2)与正常对照组相比,AngⅡ输注组大鼠肾小球足细胞nephrin表达明显减少,其磷酸化水平亦显著下降(P＜0.05).(3)与正常对照组相比,AngⅡ刺激早期(3～6 h),足细胞nephrin磷酸化表达即明显下调(P＜0.05),刺激12～24 h维持低水平表达.(4)AngⅡ刺激后,F-actin排列紊乱,逐渐向细胞外周分布形成F-actin环,CFS评分显著高于正常对照组(P＜0.05).结论 正常状态下足细胞nephrin维持一定水平磷酸化状态,AngⅡ可以诱导足细胞nephrin磷酸化水平下调.nephrin磷酸化水平改变可能是AngⅡ诱导足细胞骨架重排、足突融合的重要分子机制.     

Nephrin 与肾小球滤过膜

Nephrin是近年来在肾小球足突裂孔膜发现的第一个跨膜糖蛋白,为粘附分子类的免疫球蛋白超家族成员,可能具有细胞间粘附作用、信号传导功能及促进足细胞与足突裂孔膜发育成熟的作用.在先天性与获得性肾病存在其基因异常或mRNA表达的变化及其分布位置的改变,结果使滤过膜形态结构与屏障功能完整性破坏,导致大量蛋白尿产生.Nephrin的发现为蛋白尿病理机制的研究提供了崭新的途径,为的基因治疗带来了希望.     

阿霉素肾病大鼠肾皮质nephrin mRNA的表达及来氟米特对其表达的影响

目的:观察阿霉素肾病大鼠肾皮质nephrinmRNA的表达及来氟米特对其表达的影响,探讨nephrin在蛋白尿发生发展中的作用以及来氟米特治疗肾脏病的可能机制。方法:建立阿霉素肾病模型,第4周进一步将模型组分为治疗组和非治疗组,治疗组给予来氟米特管饲。应用光镜、电镜观察不同时期(第2、4、6、8周)各组大鼠肾组织的病理改变;BCA法检测尿蛋白排泄量;半定量RT-PCR的方法检测肾皮质中nephrinmRNA的表达。结果:(1)模型组尿蛋白量逐渐增加,而治疗组第6周和第8周的尿蛋白量均低于同时期的非治疗组水平(P=0.02和P<0.01);(2)模型组nephrinmRNA表达量在2、4、6、8周分别为对照组的0.5、1.0、2.0、1.6倍,并与尿蛋白量呈正相关(r=0.699,P<0.001);(3)模型治疗组nephrinmRNA的表达第8周达非治疗组的1.3倍。结论:(1)随着阿霉素肾病大鼠尿蛋白排泄量的增加,肾皮质nephrinmRNA的表达发生了显著变化,并与蛋白尿的发生发展之间具有一定的相关性;(2)来氟米特可减少肾病大鼠尿蛋白量,同时增加肾皮质nephrinmRNA的表达。