赖型钩端螺旋体基因库的构建及致病性钩端螺旋体DNA同源序列的克隆

作者应用质粒载体pUC9构建了肺弥漫性出血型构端螺旋体(钩体)病的主要病原——赖型钩体的基因库,并从中筛选出与致病钩体DNA同源的重组质粒pCX7和pCX9。重组质粒pCX9可识别致病钩体017株DNA1.7kb片段、601株9.0kb片段及610株30.0kb片段,而不与非致病的双曲钩体Patoc I株和illini细螺旋体DNA杂交。本研究结果进一步表明:致病钩体与非致病钩体DNA的同源性很低;致病钩体间DNA同源性较高。     

抗乙酰胆碱受体单链抗体原核表达载体及表达菌株的构建

目的将含有抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体基因的载体重新构建并建立表达菌株。方法采用聚合酶链反应(PCR)从质粒pHEN1中克隆单链抗体scFv1929#全长基因,将PCR产物再定向克隆至载体pET32a( )的多克隆位点中,并转入大肠杆菌BL21(D E3)plysS以构建表达菌株。结果PCR产物约730bp,与预期一致,重组阳性克隆菌株JM109 pET32a( )-scFv1929#经菌液PCR可见730 bp处有特异性条带,所提取质粒pET32a( )-scFv1929#经PCR及酶切鉴定正确,经测序后证实scFv1929#的核苷酸序列正确并正确地插入载体pET32a( )的读码框内。将新构建载体转化大肠杆菌BL21(D E3)plysS以获得表达菌株。结论已成功地重新构建含有抗AChR单链抗体基因的载体并建立大肠杆菌表达菌株BL21(D E3)plysS pET32a( )-scFv1929#,为今后表达抗AChR单链抗体scFv1929#融合蛋白打下基础。     

反义血管内皮细胞生长因子165基因治疗皮肤恶性黑色素瘤的实验研究

目的研究腺病毒介导的反义血管内皮细胞生长因子165(Adenovirus-mediated averse vascular endothelial growth factor16 5,Ad-aVEGF165)基因转染对恶性黑色素瘤体内外生长的影响.方法选用感染复数为100的腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Adenovirus-mediated green fluorescent protein,Ad-GFP)和Ad-aVEGF165转染人血管内皮细胞株304(endothelium cell of vessel304,ECV304)和人恶性黑色素细胞(A375).ECV304细胞分为3组A375母系组、Ad-GFP组和Ad-aVEGF 165组.A375细胞分为3组1640组、Ad-GFP组和Ad-aVEGFi65组.测定其生长曲线、细胞周期和VEGF基因的表达.于裸鼠皮下接种A375细胞,待成瘤后进行转种和治疗,根据瘤体内注射物的不同随机分为PBS组、Ad-GFP组和Ad-aVEGF165组,每组5只;治疗结束后行大体观察、HE染色观察和微血管密度(micro-vascular density,MVD)检测. 结果A375母系组和Ad-GFP组上清液均能刺激ECV304细胞的生长,Ad-aVEGF165组上清液能抑制ECV304细胞的生长.A375细胞中3组细胞均呈增殖趋势,各时间点的增殖速度比较无统计学意义(P＞0.05).ECV304细胞Ad-aVEGF 165组增殖指数降低(P＜0.05),A375细胞3组细胞增殖指数比较无统计学意义(P＞0.05).A375细胞1640组、Ad-GFP组和Ad-aVEGF165组平均灰度值分别为234.41±13.80、222.73±3.67和180.84±6.34.转种后2周Ad-aVEGF165组裸鼠体内肿瘤体积比Ad-GFP组和PBS组明显减小,并随时间延长越来越明显.HE染色Ad-aVEGFi 65组有凝固性坏死.PBS组、Ad-GFP组、Ad-aVEGF165组的MVD值分别为65±10、52±11和30±6个/视野.结论在体外,Ad-VEGF165通过抑制A375细胞VEGF基因的表达,进而抑制ECV304细胞的生长.在体内,Ad-aVEGF165阻断肿瘤血管的生成,进而抑制人恶性黑色素瘤的生长.     

反义BTEB2腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 :构建反义BTEB2重组腺病毒载体 ,以研究BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖及动脉再狭窄的影响。　方法 :从培养的大鼠VSMC中提取总RNA ,通过RT PCR制备BTEB2cDNA ,将BTEB2cDNA反向连接至腺病毒穿梭质粒pDC31 5中 ,构建重组穿梭质粒pDC31 5ASBTEB2 ,将其与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1 ,3Cre共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,采用PCR方法对其进行鉴定 ;用重组腺病毒感染VSMC ,通过RT PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达。　结果 :在病变 2 93细胞的冻融上清中含有反义BTEB2重组腺病毒 ,其滴度为 5×1 0 9ml。VSMC被重组腺病毒感染后 ,可检测到BTEB2反义RNA的表达。　结论 :成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体 ;重组腺病毒可在VSMC中表达BTEB2反义RNA ,为进一步研究BTEB2反义RNA对VSMC增殖及动脉再狭窄的影响奠定了基础     

通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究

目的　构建基因治疗通用型 AAV载体并检测它转导外源基因作用。方法　使用限制性内切酶切出p SSV9int-质粒中的 AAV病毒 Rep和 Cap基因元件后 ,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒 -p ACCMVp L p A的含有CMV启动子、多克隆位点 (MCS)和多聚腺苷酸信号 (Poly A)的表达盒 ,构建了重组 AAV通用载体质粒 p SSHG-CMV。在该质粒 MCS插入 GFP基因后 ,我们使用 p SSHG-CMV-GFP、p GF14 0和 p AAV/Ad 3种质粒共转染 2 93包装细胞 ,制备 GFP重组 AAV,应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度度 ,并将该病毒感染新生大鼠星形胶质细胞 ,荧光显微镜观察 GFP表达。结果　重组 AAV的滴度在浓缩前可达 2× 10 11,浓缩后可达 2× 10 13 ,表明成功的构建了重组 AAV载体 ,插入外源基因 GFP后 ,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下 ,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组 GFP-AAV的大鼠星形胶质细胞表达了明显的 GFP荧光。结论　本文构建的重组 AAV通用载体 p SSHG-CMV,可转导外源基因 ,用于基因治疗的研究     

CEA启动子启动双自杀基因CD/TK重组AdEasy XL腺病毒构建

目的构建含有CEA启动子(CEApromoter,Cp)启动的双自杀基因CD与TK的复制缺陷型腺病毒。方法设计带有限制性内切酶酶切序列的PCR引物。在2μlT4DNAligase作用下,Cp插入pAdTrack(pAT)的MCS,形成pAT.Cp;CD插入pAT.Cp的MCS,形成pAT.Cp.C;TK插入pAT.Cp.C的MCS,形成pAT.Cp.C.T。5μgpAT.Cp.C.T经4μlPmeI线化后,转化BJ5183AD1,1μlPacI酶切鉴定。重组AdEasy质粒转化XL10Gold细胞,大量扩增提取纯化,转染5×105AD293细胞,荧光显微镜观察,制备带有Cp.C.T重组腺病毒(recombinantadenoviruswithCp.C.T,RACp.C.T),测定病毒滴度。结果pAT.Cp,pAT.Cp.C,pAT.Cp.C.T双酶切以及PCR均见长约500bp的Cp,1300bp的CD,1100bp的TK。对照质粒DNA转化BJ5183AD1效率为7.36×106cfu/μg。线化pAT.Cp.C.T转化BJ5183AD1,形成重组AdEasy质粒DNA,PacI酶切见典型长约3.0或4.5kb与30.0kbDNA片断。重组质粒转染AD293出现绿色荧光。RACp.C.T滴度为5.67×107pfu/ml。结论RACp.C.T构建正确;AdEasyXL腺病毒载体系统转导Cp.C.T具有高效性,易于观察转染效果。     

大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因片段TA克隆载体的构建

目的：构建含大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)反义基因片段TA克性载体，为进一步研究TIMP-1在肾组织纤维化中的作用奠定基础。方法：本实验利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），从提取的大鼠肾组织总RNA中特异地扩增含313bp的TIMP-1cDNA片段，并将其克隆到TA载体。结果：用限制性内切酶鉴定313bp的TIMP-1cDNA片段插入方向，测序结果证实扩增片段为目的片段。结论：成功地构建了含大鼠TIMP-1反应基因片段TA克隆载体。     

Support vector classifiers via gradient systems with discontinuous righthand sides

Gradient dynamical systems with discontinuous righthand sides are designed using Persidskii-type nonsmooth Lyapunov functions to work as support vector machines (SVMs) for the discrimination of nonseparable classes. The gradient systems are obtained from an exact penalty method applied to the constrained quadratic optimization problems, which are formulations of two well known SVMs. Global convergence of the trajectories of the gradient dynamical systems to the solution of the corresponding constrained problems is shown to be independent of the penalty parameters and of the parameters of the SVMs. The proposed gradient systems can be implemented as simple analog circuits as well as using standard software for integration of ODEs, and in order to use efficient integration methods with adaptive stepsize selection, the discontinuous terms are smoothed around a neighborhood of the discontinuity surface by means of the boundary layer technique. The scalability of the proposed gradient systems is also shown by means of an implementation using parallel computers, resulting in smaller processing times when compared with traditional SVM packages.     

Evaluation of recombinant protein r140, a polypeptide segment of tegumental glycoprotein Sm25, as a defined antigen vaccine against Schistosoma mansoni

To investigate the role of tegumental glycoprotein Sm25 in protective immunity against schistosomiasis, codons 43-182 of its gene (GP22) were amplified by PCR and cloned in the pET 15b bacterial expression system. Recombinant protein r140 was inducibly expressed in the presence of rifampicin and purified by Ni-affinity chromatography. In different vaccination trials, Balb/c mice and Fischer rats repeatedly immunized with r140 in combination with one of several adjuvants (alum, cholera toxin or complexed into proteosomes) produced high titre anti-r140 responses. These antibodies detected an N-glycanase sensitive, 25 kDa antigen in a detergent solubilized worm fraction using Western immunoblotting. The choice of adjuvant affected the isotype distribution of the specific anti-r140 antibodies. Despite the presence of high antibody titres and isotypes which have been shown to correlate with protective immunity, protection against subsequent cercarial challenge was not observed. In addition, no appreciable effects on worm sex ratios or liver egg yields were detected in mice. Studies involving biotin labelling of membrane proteins in live worms showed that the majority of anti-r140 reactive molecules present in adult schistosomes are biotinylated after permeabilization of the parasite surface. Several possibilities to account for the lack of protective immunity are analysed .     

含人自噬基因hAPG12穿梭载体构建及其在酵母自噬中的作用

目的该研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母穿梭栽体pESC—URA—EGFP—hAPG12，将构建好的栽体转化到酵母菌内．以此研究hAPG12在酵母自噬过程中的作用。方法从pEGFP-C2-hAPG12中扩增出EGFP—hAPG12融合基因，鉴定正确后定向亚克隆到大肠杆菌一酿酒酵母穿梭载体pESC—URA中，构建载体pESC—URA—EGFP—hAPG12并将其转化到酵母，荧光显微镜下观察，用自噬诱导剂诱导酵母自噬以观察hAPG12在酵母内的表达定位。结果证实EGFP-hAPG12基因已完全正确亚克隆到pESC—URA中，荧光显微镜观察结果证明EGFP—hAPG12融合蛋白在酵母中成功表达，以诱导培养24h的荧光最强。EGFP—hAPG12定位于酵母的自噬体中。结论成功构建了具有报告基因的重组真核表达栽体pESC—LIRA—EGFP—hAPG12；EGFP—hAPG12融合蛋白在酵母中得到表达，hAPG12在酵母自噬体形成过程中起作用。