慢病毒介导核受体相关因子1基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病模型大鼠

目的探讨慢病毒介导核受体相关因子1(Nurrl)基因修饰骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植至帕金森病(PD)模型大鼠纹状体后对PD大鼠的治疗作用。方法采用神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)纹状体注射成功制备PD大鼠模型18只,将携带绿色荧光的慢病毒GV287-Nurr1感染大鼠BMSCs,然后随机移植入6只PD模型大鼠的纹状体内(实验组),设生理盐水组(假移植组)6只及感染空慢病毒GV287的BMSCs组(对照组)6只;术后第1、2、4周观察大鼠的行为改善情况;免疫组织化学染色法检测纹状体及黑质中Nurrl和酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达变化;RT-PCR法检测黑质Nurrl mRNA和TH mRNA的表达变化。结果慢病毒感染后的BMSCs及上清中均检测到Nurr1蛋白;对照组与实验组大鼠在移植后第1、2、4周的旋转行为较假移植组均有所改善,且实验组比对照组改善更明显;实验组纹状体Nurr1阳性细胞有效存活并沿胼胝体向皮质及对侧脑组织迁移;实验组纹状体及黑质损毁侧Nurrl和TH蛋白及mRNA的表达较假移植组和对照组明显增高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论慢病毒介导Nurr1基因修饰大鼠BMSCs移植治疗PD大鼠,能有效地改善PD模型大鼠的行为学症状,增加大鼠脑内纹状体和黑质区Nurr1和TH的表达。     

靶向结缔组织生长因子shRNA慢病毒表达载体的构建及病毒包装

目的构建靶向结缔组织生长因子（CTGF）的shRNA慢病毒载体并检测其介导的RNA干扰（RNAi）对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）CTGF表达的影响,为进一步研究CTGF在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中的功能奠定基础。方法设计并合成三对针对CTGF的siRNA,通过WesternBlot筛选有效靶点,合成有效靶点的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与线性化的pGC-LV-GFP载体连接,通过PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序鉴定;将重组CTGFshRNA的质粒与病毒包装的辅助质粒共转染295T细胞,将包装产生的慢病毒感染ARPE-19细胞,WesternBbt检测CTGF的表达。结果通过双酶切和基因测序证实靶向CT-GF的shRNA慢病毒载体构建成功,Western Blot证实经慢病毒感染后的ARPE-19细胞中的CTGF的蛋白水平明显减低。结论成功构建了靶向CTGF的shRNA慢病毒表达载体,体外感染ARPE-19细胞可有效降低CTGF蛋白的表达,为深人研究CTGF在PVR中的功能提供了有力的工具。     

靶向SMC1A基因慢病毒介导的RNA干扰对奥沙利铂治疗敏感性的影响

目的 探讨沉默结直肠癌细胞株染色体结构维持-1A（SMC1A）基因对奥沙利铂（L-OHP）敏感性的影响。方法 构建SMC1A基因的小分子RNA干扰表达质粒。与慢病毒包装质粒一起转染239T细胞制备pGCSIL-GFP／SMC1A-siRNA慢病毒载体,并将重组质粒转染结直肠癌SW480、HT-29细胞株。RT-PCR、Western blotting法检测SMC1A mRNA和蛋白的表达情况。CCK-8法检测不同浓度L-OHP对细胞的抑制作用。 结果 pGCSIL-GFP／SMC1A-siRNA慢病毒载体构建成功,RT-PCR产物为343bp。RT-PCR显示重组质粒转染的SW480、HT-29细胞SMC1A mRNA表达量明显低于其对应的未转染细胞（0.13±0.02 vs. 1.02±0.06,0.182±0.019 vs. 1.114±0.032;P＜0.05）;Western blotting 显示干扰后的细胞SMC1A蛋白表达受到明显抑制;不同浓度的L-OHP处理细胞48h后,CCK-8显示转染SMC1A-siRNA细胞生长抑制率较未转染细胞高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 沉默结直肠癌细胞株SMC1A基因对奥沙利铂的敏感性显著增加,为临床进一步提高结直肠癌的疗效提供了研究基础。     

重组慢病毒介导的OPCML基因的体外转导及其对卵巢上皮性癌细胞的抑制作用

目的探讨重组慢病毒介导的体外转导OPCML基因的可行性及其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的抑制作用。方法采用PCR技术,用基因特异性引物将OPCML基因的cDNA从CD1小鼠脑组织中扩增,并将OPCML基因克隆到慢病毒载体表达质粒pWPI GFP上,构建慢病毒载体表达质粒pWPI OPCML;将pWPI OPCML或pWPI GFP(空载体对照)质粒和包装质粒pCMVdR8.74、pMDG共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OPCML和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒WPI OPCML或仅携带GFP基因的重组慢病毒WPI GFP;用重组慢病毒WPI OPCML和WPI GFP分别转导靶细胞,即人卵巢癌细胞系A2780、OCC1细胞和小鼠正常卵巢上皮细胞系CD1细胞,以未转染任何基因者为空白对照。通过细胞增殖实验、细胞聚合力实验、细胞周期分析和体内成瘤实验观察OPCML基因对卵巢癌细胞的抑制作用。结果(1)OPCML基因能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞,转导效率几乎达100%,并稳定表达;蛋白印迹法检测显示,靶细胞中OPCML和GFP蛋白均有表达。(2)细胞增殖实验显示,A2780细胞中,转导OPCML基因72h后的A2780/OPCML细胞为(7.6±1.0)×105个,明显少于未转导基因的A2780细胞或仅转导空载体的A2780/pWPI细胞[分别为(20.0±2.6)×105和(18.1±1.7)×105个;P<0.01];但OCC1和CD1细胞中,OPCML基因对细胞的增殖无明显的影响(P>0.05)。(3)细胞周期分析显示,OPCML基因对A2780细胞的细胞周期有明显的阻滞作用(转导前、后G0～G1期细胞分别为67%、75%;P<0.05),但对OCC1、CD1细胞则无明显阻滞作用(P>0.05)。(4)细胞聚合力实验显示,与空载体对照相比,OPCML基因能明显增强细胞的黏附力(P<0.05)。(5)移植瘤实验显示,将A2780/OPCML细胞注射到裸鼠皮下,4只裸鼠中仅1只裸鼠有肿瘤生长,其肿瘤重量为10mg,显著低于注射A2780、A2780/pWPI细胞的裸鼠[各4只裸鼠均有肿瘤生长,其肿瘤重量分别为(280±53)及(677±323)mg;P<0.01]。免疫组化法检测显示,肿瘤组织中OPCML蛋白有表达。结论用重组的慢病毒载体作为转基因的工具,具有高效性,同时能使目的基因达到持续稳定的表达。OPCML基因能够增加A2780细胞的黏附能力,抑制A2780细胞的增殖和体内成瘤,提示OPCML基因可能是一个新的抑癌基因。     

肿瘤抑素抑制肝癌移植瘤生长的实验研究

目的 观察肿瘤抑素慢病毒载体对裸鼠肝癌移植瘤生长的抑制作用,探讨其在肝癌基因治疗中的应用前景。方法 建立人肝癌细胞株SMCC-7721裸鼠皮下移植瘤模型,当肿瘤直径达到0.3～0.5cm时分别在瘤周及瘤体内多点注射100μl磷酸盐缓冲液（PBS组）、5×109 TU慢病毒绿色荧光蛋白（Lenti-GFP组）和5×109 TU 肿瘤抑素重组慢病毒（Lenti-Tum组）。观察3组的肿瘤体积变化,采用RT-PCR和Western blotting法分别检测3组肿瘤组织中肿瘤抑素的mRNA和蛋白水平,并采用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果 注射21天后,Lenti-Tum组的肿瘤体积为（702.1±143.7）mm3,小于PBS组的（1622.2±253.8）mm3和Lenti-GFP组的（1538.5±284.9）mm3（P＜0.05）;Lenti-Tum组的抑瘤率为56.7％,显著高于Lenti-GFP组的5.2％（P＜0.05）;Lenti-Tum组中肿瘤抑素的mRNA和蛋白水平均高于其他两组。Lenti-Tum组小鼠的中位生存时间为100天,明显高于PBS组的58天和Lenti-GFP组的59天（P＜0.05）。结论 肿瘤抑素经慢病毒转染能够明显抑制肝癌移植瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的生存时间。     

沉默VEGF对人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R侵袭迁移的影响

目的 探讨沉默血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）对人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R迁移和侵袭能力的影响。方法 制备含VEGF-shRNA的慢病毒载体（VEGF-LV1、VEGF-LV2、VEGF-LV3）和对照shRNA重组慢病毒（VEGF-NC）,并转染人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R,建立稳定沉默VEGF细胞（CNE-LV1、CNE-LV2和CNE-LV3）和阴性对照细胞（CNE-NC）。采用RT-qPCR和Western blot法检测细胞转染效果,划痕实验和Transwell小室实验检测VEGF沉默后细胞的迁移和侵袭能力。结果 成功构建VEGF-shRNA重组慢病毒并建立了稳定沉默VEGF细胞CNE-LV3。划痕实验和Transwell小室迁移实验显示,与空白对照组和CNE-NC组相比,CNE-LV3组细胞迁移率明显降低［（50.17±1.76）% vs （37.97±1.56）%,P＝0.001;（50.63±1.52）% vs （37.97±1.56）%,P＝0.001］,穿膜细胞数亦明显下降［（95.3±3.8） 个 vs （41.3±1.5） 个,P＜0.001;（94.3±4.0） 个 vs （41.3±1.5） 个,P＜0.001］;Transwell小室侵袭实验结果亦显示,CNE-LV3组细胞穿膜细胞数较空白对照组和CNE-NC组明显下降［（46.3±2.1） 个 vs（105.3±1.5） 个,P＜1.001;（46.3±2.1） 个 vs （93.3±2.5） 个,P＜0.001］。结论 沉默VEGF表达可抑制人鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的迁移和侵袭能力。     

大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体的构建及其对大鼠RPE细胞中Slit2基因的下调作用

背景 年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人致盲的首要原因.目前,AMD的治疗方式在取得显著疗效的同时亦有一定的不足,寻找新的有效治疗靶点是当前的研究热点. 目的 构建大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体,筛选有效干扰序列以用于大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞中Slit2基因沉默,为大鼠相关体内实验奠定基础.方法 设计2条大鼠Slit2基因siRNA序列,退火形成DNA,连接形成慢病毒干扰载体并进行测序鉴定.采用三质粒共转染293T细胞法收获慢病毒(Lv-rSlit2-siRNA),用药物筛选法测定病毒悬液滴度.将大鼠RPE细胞分为空白对照组、空病毒组、Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组,根据分组分别用仅有病毒的载体和不同序列的Lv-rSlit2-siRNA载体转染细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定各组细胞中Slit2 mRNA及蛋白的表达以确定Slit2基因的敲减率,筛选有效干扰序列.采用0、100、200和400μmol/L CoCl2孵育大鼠RPE细胞以制备缺氧细胞模型并转染筛选Lv-rSlit2-siRNA2干扰序列,采用实时荧光定量PCR法和ELISA法测定大鼠RPE细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)表达变化及细胞上清液中VEGFA质量浓度.结果 成功构建2条大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体,病毒滴度分别为5×108 TU/ml和3×108 TU/ml,转染病毒后72 h于荧光显微镜下观察RPE细胞慢病毒转染率均在70％以上.Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2 mRNA相对表达量分别为0.67±0.09和0.23±0.11,明显低于空白对照组的1.03±0.31和空病毒组的0.92 ±0.07;Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2蛋白相对表达量分别为0.62±0.07和0.49±0.02,明显低于空白对照组的1.00±0.10和空病毒组的0.95±0.11,差异均有统计学意义(均P＜0.01).0、100、200和400 μmol/L CoCl2作用后,空白对照组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFA mRNA的相对表达量明显不同,差异均有统计学意义(F浓度=127.998,P＜0.01;F分组=69.663,P＜0.01),不同浓度CoCl2作用后各组大鼠RPE细胞中VEGFA蛋白相对表达量均明显不同,差异均有统计学意义(F浓度=17.059,P＜0.01;F分组=91.791,P＜0.01).100、200和400 μmol/LCoCl2作用后Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFA mRNA表达量及蛋白质量浓度均明显低于空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体构建成功并筛选出有效干扰重组序列,其能有效下调大鼠RPE细胞中Slit2基因的表达,并抑制缺氧环境下VEGFA在大鼠RPE细胞中的表达.     

慢病毒介导I型胶原短发夹RNA转染对大鼠系膜细胞生长行为的影响

目的通过观察慢病毒介导的I型胶原（COLI）短发夹（sh）RNA感染大鼠系膜细胞后其增殖、凋亡及细胞周期的变化,探索未来应用于动物实验,甚至临床时RNA干涉（RNAi）药物对靶细胞生长行为的影响。方法利用感染增强剂（对照组）、空慢病毒载体及感染增强剂（pSC-GFP组）、COLIshRNA慢病毒表达载体及感染增强剂（pSC—GFP／COLI组）分别感染大鼠系膜细胞,用噻唑蓝法检测细胞增殖,利用AnnexinV／PE法检测细胞凋亡,利用流式细胞仪检测细胞周期,进而观察慢病毒表达载体对细胞上述能力的影响。结果pSC—GFP／COLI组和pSC—GFP组均能显著抑制细胞增殖,且慢病毒表达载体抑制能力又显著高于空病毒,分别于感染后24h、48h和72h计算抑制效率为22．52％、28．57、33．33％。凋亡实验结果表明,慢病毒感染细胞后一定程度诱导了细胞凋亡,但作为载体携带的COLIshRNA未引起进一步的细胞凋亡加剧。细胞周期实验发现慢病毒引起细胞周期阻滞于G2／M期。而在72hCOLIshRNA对s期的阻滞逐渐突出。结论慢病毒介导I型胶原短发夹RNA转染大鼠系膜细胞后,在一定程度上影响了细胞生长行为,但总体来说仍是安全的,为进一步动物实验及药物研制奠定基础。     

负载hTERT调控相关miR-138慢病毒的包装及鉴定

目的:构建hTERT(人端粒酶逆转录酶)调控相关miR-138慢病毒表达载体.方法:化学合成miR-138前体序列,连接到包含U6启动子及GFP(绿色荧光蛋白)报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,经双酶切和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0共转染至HEK 293T细胞包装病毒,并对病毒进行鉴定.结果:双酶切和测序结果证实miR-138前体核苷酸链序列捕入正确,包装的慢病毒滴度达7×107TU/ml;包装成功的慢病毒可有效增加感染细胞内miR-138的表达丰度,并可下调hTERT表达水平.结论:成功包装并鉴定人miR-138慢病毒表达载体.     

Survivin shRNA重组慢病毒构建及对A549细胞增殖的影响

背景与目的 Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的成员,在多种肿瘤组织中高度表达而在终末分化细胞中极少表达,因此可以作为癌症治疗的理想靶点.本研究旨在通过构建Survivin基因shRNA的慢病毒质粒并干扰肺癌细胞A549中Survivin的表达,分析其对细胞增殖的影响.方法 设计Survivin干扰靶序列,构建重组质粒;将pLL3.7-Survivin转染293T细胞后利用Hela细胞检测病毒的滴度并感染A549细胞,应用RTPCR和Western blot检测干扰效果;MTT与流式细胞术分析其对细胞增殖的影响.结果 本研究成功构建了重组质粒;重组质粒可抑制A549细胞中Survivin基因的表达;细胞受阻于G2/M期.结论 本研究构建的重组质粒可抑制Survivin基因的表达并影响细胞的增殖,其为研究RNAi介导的肺癌基因治疗打下基础.