慢病毒介导的Isll基因在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的研究慢病毒介导的Isll基因在人骨髓间充质干细胞（hMsc）中的表达情况,并检测其下游基因Nkx2．5和Flk一1的表达。方法多位点Gateway载体构建技术构建2K7puro／EF1α-Isll慢病毒表达载体（由EF1α启动子启动Isll基因表达）。包装细胞293FT细胞获得慢病毒,再转染至hMSC。利用嘌呤霉素抗性筛选出Isll阳性细胞。应用RT．PCR、Westernblotting检测hMSC中Isll基因在转染后1-6周的mRNA和1—4周的蛋白表达情况。结果成功构建了慢病毒载体EF1α—Isll,转染后hMSC中检测出Isll基因mRNA和蛋白的表达,其mRNA表达随着培养时间延长而上调,第3周表达量（0．65±0．14）较1、2周增多（0．36±0．09,0．37±0．05,均P〈0．05）,3周后表达趋于稳定。转染后在无任何诱导剂的情况下,检测到Isll下游基因Nkx2．5的表达,但尚未见Flk-1的表达。结论通过慢病毒载体将Isll基因转染hMSC后,可获得长期稳定的表达,并在无任何诱导剂的情况下,能促进下游基因Nkx2．5的表达。     

Immune selection of equine infectious anemia virus env variants during the long-term inapparent stage of disease

The principal neutralizing domain (PND) of equine infectious anemia virus (EIAV) is located in the V3 region of SU. Genetic variation in the PND is considered to play an important role in immune escape and EIAV persistence; however, few studies have characterized genetic variation in SU during the inapparent stage of disease. To better understand the mechanisms of virus persistence, we undertook a longitudinal study of SU variation in a pony experimentally inoculated with the virulent EIAV(Wyo). Viral RNA isolated from the inoculum and from sequential sera samples was amplified by RT-PCR, cloned, and individual clones were sequenced. Of the 147 SU clones obtained, we identified 71 distinct V3 variants that partitioned into five major non-overlapping groups, designated PND-1 to PND-5, which segregated with specific stages of clinical disease. Genotypes representative of each group were inserted into an infectious molecular clone, and chimeric viruses were tested for susceptibility to neutralization by autologous sera from successive times post-infection. Overall, there was a trend for increasing resistance to neutralizing antibody during disease progression. The PND genotype associated with recrudescence late in infection was resistant to both type-specific and broadly neutralizing antibody, and displayed a reduced replication phenotype in vitro. These findings indicate that neutralizing antibody exerts selective pressure throughout infection and suggest that viral strategies of immune evasion and persistence change in the face of an evolving and maturing host immune response.     

大鼠心肌素慢病毒RNA干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞分化的影响

目的: 构建大鼠心肌素(myocardin)慢病毒RNA干扰(RNAi)重组质粒,分析该RNAi质粒的干扰效果及其对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法: 设计并合成3对针对大鼠myocardin的shRNA片段,退火后将双链oligo-DNA克隆入慢病毒质粒载体pGCSIL- GFP获得重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd。以pEGFP-N1 / X124G表达载体构建含Flag标签的myocardin表达质粒pEGFP-N1- Myocd。将重组干扰质粒和过表达质粒共转染293T细胞,Western blotting分析Flag标签蛋白的表达,筛选出干扰效率最好的干扰质粒并大量扩增。干扰质粒转染大鼠主动脉VSMCs,RT-PCR和Western blotting检测myocardin及分化标志物SM22α的表达。结果: 成功构建大鼠myocardin的慢病毒干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd和过表达质粒pEGFP-N1-Myocd。上述2种质粒共转染293T细胞后,1号干扰质粒转染组Flag标签蛋白表达下降最显著。将1号质粒进行大包装,获得滴度为1×10¹² TU/L的慢病毒颗粒,该病毒转染VSMCs后,myocardin表达明显下调并伴随分化标志物SM22α表达的显著下降。结论: 成功构建大鼠myocardin慢病毒重组干扰质粒pGCSIL- GFP-shMyocd;抑制基因myocardin表达后伴随VSMCs分化的表达下降,提示myocardin在VSMCs分化过程中的重要性。pGCSIL- GFP-shMyocd重组质粒的成功构建为后续研究特定病理条件下(如动脉粥样硬化)VSMCs表型转变的分子机制奠定了基础。     

慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞中的表达

研究慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达情况,并检测其下游基因Nkx2.5和Flk-1的表达。方法 多位点Gateway载体构建技术构建2K7puro/EF 1α-Isl1慢病毒表达载体(由EF1α启动子启动Isl1基因表达)。包装细胞293FT细胞获得慢病毒,再转染至hMSC。利用嘌呤霉素抗性筛选出Isll阳性细胞。应用RT-PCR、Western blotting检测hMSC中Isl1基因在转染后1～6周的mRNA和1～4周的蛋白表达情况。结果　成功构建了慢病毒载体EF1α-Isl1,转染后hMSC中检测出Isl1基因mRNA和蛋白的表达,其mRNA表达随着培养时间延长而上调,第3周表达量(0.65±0.14)较1、2周增多(0.36±0.09,0.37±0.05,均P＜0.05),3周后表达趋于稳定。转染后在无任何诱导剂的情况下,检测到Isl1下游基因Nkx2.5的表达,但尚未见Flk-1的表达。结论通过慢病毒载体将Isl1基因转染hMSC后,可获得长期稳定的表达,并在无任何诱导剂的情况下,能促进下游基因Nkx2.5的表达。     

构建与制备RhoA-GTPase 突变体慢病毒

目的　构建携带绿色荧光蛋白的RhoA显性负效突变体（RhoAN19）和组成型活性突变体（RhoAL63）慢病毒。 方法　构建RhoAN19和RhoAL63慢病毒表达质粒,并以酶切及序列测定方法进行鉴定。利用ViraPowerTM 慢病毒表达系统包装制备RhoA突变体慢病毒上清,用其感染大鼠前皮质神经元,分别进行RhoA生物学活性检测、细胞转染效率鉴定与神经元形态学观察。 结果　构建的RhoAN19和RhoAL63慢病毒表达质粒经酶切与测序鉴定正确,包装的慢病毒滴度为1×106 TU/ ml。用制备的慢病毒上清感染原代培养的前皮质神经元,生物学活性检测结果显示RhoAN19慢病毒显著抑制溶血磷脂酸（LPA）诱导的RhoA活性的升高,而RhoAL63慢病毒感染神经元后RhoA活性显著升高。感染效率鉴定结果显示病毒上清可感染80%以上的前皮质神经元。形态学观察显示经慢病毒感染后的神经元其胞体与树突分支清晰可见。 结论　成功制备了RhoA突变体慢病毒,并成功实现了慢病毒感染前皮质神经元,为进一步研究Rho蛋白家族信号通路提供了研究工具。     

STAT1过表达慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的：构建STAT1基因过表达慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。方法：根据人STAT1基因mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞DH5OC,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用荧光定量PCR和Westernblot检测原始细胞株（MHCC97L）,稳转细胞株（MHCC97－statl）中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性。结果：测序证实STAT1基因过表达载体构建成功。过表达慢病毒包装成功。慢病毒转染人肝癌细胞MHCC97L48h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达显著增加。结论：STAT1基因过表达慢病毒载体构建成功,并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

体外利用慢病毒介导BMP-2基因诱导兔滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化

目的使用慢病毒介导兔BMP-2基因转染兔滑膜间充质于细胞（SMSCs）,检测其安全性,并在体外定向诱导至软骨细胞。方法通过构建包含BMP-2基因的慢病毒载体,转染SMSCs后行安全性分析;各项检测和MicroRNA分析判断转染后的SMSCs是否进入软骨细胞分化谱系。结果贴块法获得的SMSCs在经分离纯化后,表现出间充质干细胞应有的结构和表面标志物,具有多向分化潜能。增殖动力学、核型分析、致瘤型分析等证实被慢病毒转染的SMSCs安全。Westernblot、免疫荧光等证实且能稳定表达BMP-2蛋白。14d后,免疫组化、MicroRNA检测等证实在不需外加外源性BMP-2的体外环境下SMSCs可自发向软骨细胞分化。结论经重组慢病毒载体感染的兔SMSCs足够安全,能稳定表达BMP-2,体外能自发向软骨细胞分化。     

慢病毒介导的双自杀基因诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的 观察慢病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因体系对胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤作用.方法 用重组慢病毒FGW-KDRP-CD/TK体外感染SGC-7901细胞.噻唑蓝(MTT)比色法检测前药对细胞的杀伤效应;透射电镜及流式细胞术观察细胞凋亡及细胞内DNA含量.结果 慢病毒的感染率随病毒滴度的增高而递增.当前药更昔洛韦(GCV)为100 mg/L、5-氟胞嘧啶(5-FC)为320 mg/L时,对未转基因及转基因细胞的抑制率分别为18%、94%,两者筹异有统计学意义(P<0.01).电镜下用药组出现细胞凋亡.流式细胞仪检测显示,随着药物浓度的增加,凋亡细胞所占的比例逐渐增加.结论 KDR启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤SGC-7901细胞,并且该体系可以诱导胃癌细胞凋亡.     

胸腺素β4基因沉默对膀胱移行细胞癌上皮间质转化的逆转作用

目的 观察胸腺素β4(Tβ4)基因沉默对膀胱癌细胞上皮间质转化(EMT)的逆转,探讨其在肿瘤侵袭转移中的作用机制.方法 使用针对Tβ4的慢病毒载体(knti-Tβ4)转染膀胱癌细胞株T24.采用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法检测Tβ4、整合素连接激酶(ILK)和上皮性标记基因E-cadherin、β-catenin的表达改变;Immunofluorescence法检测ILK、E-cadherin、β-catenin在转染后124细胞中的表达改变;细胞划痕实验、Boyden小室体外侵袭实验、AO/EB荧光染色法反映细胞转移潜能和凋亡的变化.结果 转染后48 h的T24细胞,Tp4、ILK、β-catenin mRNA或蛋白表达开始下降,以转染后96 h明显;而上皮标记基因E-cadherin在转染96h后,表达显著增加(P<0.05);Immunofluorescence显示ILK和β-catenin在细胞质、细胞核中表达减弱,而E-cadherin在胞膜中表达增强,细胞形态向正常上皮细胞转化;转染后的324细胞体外迁移能力与侵袭力下降[(10.4±1.2)%比(73.5±1.4)%],细胞凋亡增多(12.3%比36.6%).结论 肿瘤细胞中的Tβ4表达下调可以逆转肿瘤细胞的间质表型,而向正常上皮表型转化,降低肿瘤转移潜能.