Rapid and simple isolation of DNA from agarose gels

Summary We present a simple method for the isolation of DNA from agarose gels that is economic, fast, and independent of electrical equipment. DNA fragments of up to 6 kb can be easily extracted within 5 min using a disposable plastic syringe and filter paper. Total extraction of DNA fragments between 10 and 20 kb in size is achieved by concentrating the DNA flushed from the gel in a DNA-binding column.     

rhTPO在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性分析

目的：探讨人促血小板生成素(human thromlbopoietin，hTPO)在大肠杆菌中表达、分离纯化及生物学活性初步鉴定。方法：利用RT-PCR法从人胎肝细胞中扩增目的基因片段，将其定向插入pQE30表达质粒T5启动子下游的多克隆区，转化大肠杆菌M15，得到pQE30-TPO的工程菌，诱导目的蛋白表达、纯化。将表达产物给血小板减少模型小鼠尾静脉注射，观察注射后不同时间血小板量的改变。结果：经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside IPTG)诱导培养，该工程菌可以产生单一特异性的高表达蛋白条带。将纯化后的表达蛋白注射小鼠，结果显示对实验性小鼠血小板减少症具有一定的治疗作用。结论：在大肠杆菌中成功地高效表达了重组hTPO，该产物具有促血小板生成的活性。     

实时荧光定量PCR检测PML-RARα融合基因的临床应用研究

目的 利用PML-RARα融合基因作为标志物,应用实时荧光定量PCR技术,监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(minimal residual disease,MRD)患者体内病毒的状态,探讨预测APL复发风险的方法.方法 利用本实验室建立的定量检测APL患者PML-RARα融合基因的方法,对25例处于初诊、完全缓解(complete remission,CR)、复发等不同阶段的APL患者进行了PML-RARα融合基因的定量检测,并对其中6例患者的MRD状态进行了动态监测.结果 应用荧光定量PCR技术分析患者初诊、CR和复发状态的PML-RARα基因对数值(lg)水平,结果 显示有统计学意义(x2=6.847,P＜0.05);随访期患者的PML-RARα对数值(lg)水平变化较大:初诊时较高(-0.61±0.79),CR时下降(-1.31±0.62),复发时又出现上升(-0.57±0.44),提示若该患者在CR时的对数值呈现上升趋势,患者复发的机率大.结论 应用实时荧光定量(RQ)-PCR技术定量检测PML-RARα融合基因,对监测APL患者MRD状态具有临床适用性,随访期的MRD动态追踪监测具有预后价值.     

有性生殖物种的单亲繁殖

生物科技的进步，如转基因技术与细胞核转移技术，不但改变了生物学与医药学的研究模式，更加深了和革新着我们对人类自身生物学特性的认识。通过定义线粒体DNA为转基因，我们曾提出核化线粒体组学与转基因人的新概念。鉴于有关克隆人的技术安全性与伦理学的争论。探讨了是否存在天然克隆人的可能性及检验这一可能性的相关研究途径；同时还探讨了单亲繁殖在遗传诊断中可能具有的指导作用。     

Rb基因对人视网膜母细胞瘤株SO-Rb50的影响

目的：探讨视网膜母细胞瘤（Rb）的发生与Rb基因（Rb1）缺失、失活等异常的关系。方法：用逆转录病毒载体pDOR与全长4．7kb野生型Rb1cDNA构建逆转录病毒表达载体pDOR－Rb1+。用脂质体介导法将pDOR－Rb1+转入CRIP包装细胞系。结果：实验产生了0．5X105Cfu具有一次感染能力的重组逆转病毒。利用该病毒感染SO-Rb50，经G418筛选，获得了抗G418细胞群体。运用PCR及Southern杂交技术对转染细胞进行检测，结果表明该抗G418细胞中有完整的外源Rb1存在。Northern杂交发现其Rb1mRNA表达水平有所提高。对细胞群体生长速率、软琼脂集落形成能力的测定表明，外源Rb1的表达使SO-Rb50在软琼脂中集落形成能力降低，而群体生长速率无明显影响。结论：外源Rb1对SO-Rb50恶性表型有一定影响。     

SEN病毒D亚型ORF1-C端基因的克隆、表达和鉴定

目的:获得SENV-D亚型ORF1-C端蛋白基因序列,并进行表达,为进一步研究及诊断、治疗应用奠定基础.方法:用PCR法从SENV阳性血清中获得SENV-DORF1C端基因,测序验证后,构建了pQE30-SENV-D重组表达质粒,并经过转化E.coli M15,IPTG诱导表达,Western blot分析表达结果.结果:获得了正确序列的SENV-D亚型ORF1-C端蛋白基因序列,表达出Mr约为38×103的蛋白.表达蛋白能与患者血清中相应的抗体结合,发生抗原抗体反应.结论:成功获得并表达了SENV-D-ORF1-C端蛋白,并经Western blot印迹法证实能与阳性血清中的抗体发生抗原抗体反应,有可能用于检测SENV-D抗体.为今后进一步研究有助于疫情监测及早期发现感染者的抗体奠定了坚实的基础.     

重庆市新生儿高胆红素血症患儿G6PD基因突变类型及临床特点

目的研究重庆市新生儿黄疸儿G6PD三种常见基因突变与其临床表现特点之间的关系。初步估计其基因突变频率并探讨其临床意义和遗传学特征。方法应用突变特异性扩增系统(ARMS)法,检测54例重庆市新生儿黄疸儿的G6PD基因突变类型。结果检出G1388A突变39例(72%),G1376T突变8例(15%),未定型者7例(13%)。未检出G95A。结论本研究首次对重庆市新生儿黄疸儿进行G1388A、G1376T和A95G突变检测。提示G1388A和G1376T为重庆市新生儿黄疸儿G6PD缺乏症基因突变的主要类型。ARMS法是一种简便、快速、经济的检测G6PD已知基因突变的方法。本研究发现这两种突变类型仅见于中国人和华裔人群,具有遗传学及临床意义。     

Smith-Fineman-Myers综合征的候选基因GPC4分析

目的:探讨GPC4基因与中国山东Smith-Fineman-Myers综合征(SFMS)的关系,并分析SFMS患者GPC4基因突变。方法:利用primer3设计扩增GPC4全部编码序列及内含子和外显子接头序列的引物,采用PCR扩增结合PCR产物直接测序方法检测GPC4基因开放性阅读框架区域基因突变。结果:在GPC4基因开放性阅读框架区域内并未检测到导致疾病的基因突变。结论:山东SFMS家系患者不是由于GPC4基因编码区域基因突变所致。     

腺病毒介导的NT-3基因在骨髓间质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒介导的NT-3基因在培养的大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达.方法:在293细胞中培养扩增NT-3重组腺病毒(adenovirus vector for NT-3,Ad-NT-3),测定病毒滴度,然后用Ad-NT-3感染传代培养的MSCs,RT-PCR技术检测NT-3基因的表达.结果:Ad-NT-3扩增后获得了较高滴度的病毒,MSCs经Ad-NT-3感染后有NT-3 mRNA的转录.结论:腺病毒介导的NT-3基因可转入培养的MSCs并高效表达,为NT-3基因治疗的研究奠定了基础.     

病毒白细胞介素-10转基因在造血干细胞中的表达

目的　观察逆转录病毒转病毒白细胞介素 10 (vIL 10 )基因在体内的表达。方法　用MSCVneo vIL 10重组体在体外转导CBA (H 2 K)小鼠的造血干细胞 (HSCs) ,给经致死照射(90 0rads)的 2 0只同基因CBA(H 2 K)小鼠注入经MSCVneo vIL 10转染的HSCs ,2× 10 6HSCs/只。酶联免疫吸附测定 (ELISA)、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )、Westernblot分析vIL 10的表达。结果　移植MSCVneo vIL 10转染HSCs的 2 0只小鼠 ,移植后 8周用ELISA检测 ,其中 15只小鼠血清的vIL 10浓度为 :2 70～ 13 40ng/L ,5只小鼠血清的vIL 10为阴性。 12周后有 2只小鼠vIL 10测不出 ,13只小鼠长时间表达vIL 10达 6个月。对照组小鼠血清vIL 10均为阴性。RT PCR和Westernblot证实小鼠的器官均有vIL 10的mRNA和蛋白的表达。结论　逆转录病毒能有效地将vIL 10基因导入造血干细胞并在体内长时间表达。