原发瘤切除对荷人骨肉瘤裸鼠血管生成和肺转移的影响

目的 研究原发瘤切除对骨肉瘤血管生成和肺转移的影响,并探讨其可能的机制及临床意义.方法 用细胞悬液法构建倚人骨肉瘤裸鼠模型,分为实验组(切除原发瘤)、截肢对照组(不切除原发瘤的截肢手术)和空白对照组.用酶联免疫吸附试验(ELISA)法,检测手术前后裸鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)和内皮抑素的表达水平.用HiCN法检测裸鼠体内Matrigel胶体中血红蛋白浓度.应用膨胀压片计数法和组织切片苏木素-伊红对比染色法,观察肿瘤肺部转移灶的情况.结果 手术后实验组血清中的VEGF和内皮抑素浓度较空白对照组和截肢对照组有明显的下降,且内皮抑素下降幅度更大[VEGF分别为(71.43±9.15)pg/ml、(115.81±4.38)pg/ml和(111.68±12.26)ps/ml(P<0.01);内皮抑素分别为(40.77±5.41)ng/ml、(123.18±5.94)ng/ml和(128.06±4.52)ng/ml(P<0.01)];实验组、空白对照组和截肢对照组Matrigel小体中血红蛋白浓度分别为(36.55±2.35)g/L、(16.84±1.15)g/L和(16.29±1.10)g/L(P<0.01).实验组、空白对照组和截肢对照组的肺转移率分别为80.0%、40.0%和35.0%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 原发瘤切除可使荷人骨肉瘤裸鼠体内的VEGF和内皮抑素比例失衡,有利于肿瘤血管生成和肺转移,故原发瘤切除后及时抑制肿瘤血管生成,对降低骨肉瘤肺转移有重要意义.     

重组人血管内皮抑制素治疗人乳腺癌裸鼠模型的实验研究

目的 探讨重组人血管内皮抑制素注射液(恩度,YH-16)对人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 建立人乳腺癌裸鼠模型,随机分成4组,每组10只,接种人乳腺癌细胞悬液,瘤体达1.0 cm3时,于种植部位皮下注射药物:阴性对照组生理盐水0.2 mg/kg体重,阳性对照组顺铂(DDP)1 ms/ks体重,YH-16组YH-16 20 ms/kg体重,DDP联合YH-16组为DDP1 mg/kg体重和YH-16 20 ms/ks体重,隔日一次,20 d后颈椎脱位处死裸鼠,检测裸鼠体重、肿瘤体积、抑瘤率、血管内皮生长因子(VEGF)、癌细胞凋亡率、肺转移率.结果 DDP联合YH-16组、阳性对照组、YH-16单药组、阴性对照组肿瘤体积分别为(0.686±0.229)、(1.258±0.101)、(1.888±0.215)、(3.366±0.284)cm3;抑瘤率分别为92.1%、57.3%、36.5%、0;肺转移率分别为0、10%、20%、90%;癌细胞凋亡率分别为31.6%±2.7%、28.1%±2.7%、19.4%±2.9%、15.7%±3.2%;RT-PCR检测VEGF表达,吸光度(A)比值均数分别为0.530±0.164、0.759±0.210、1.063±0.295、1.268±0.145,Western blot检测结果为0.260±0.0820、0.348±0.085、0.461±0.099、0.556±0.113,以上各组间差异均有统计学意义(P<0.05).结论 YH-16对人乳腺癌裸鼠肿瘤生长及远处转移均有抑制作用,不良反应小;YH-16联合DDP有协同增效作用.     

内皮抑素体外抑制喉鳞状细胞癌细胞的效果观察

目的探讨内皮抑素对喉鳞状细胞癌(简称喉癌)细胞(Hep-2)和人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)的作用及其可能的机制。方法①MTT法检测,10μg/ml～50μg/ml的内皮抑素作用72小时和30μg/ml的内皮抑素作用24～72小时对Hep-2和HUVEC的影响;②电镜观察,加药前后Hep-2和HUVEC的超微结构;③RT-PCR法检测,加药前后Hep-2中survivin基因的表达;④光镜观察,内皮抑素(30μg/ml)对体外人造血管模型的影响。结果①内皮抑素(20μg/ml～50μg/ml)能抑制Hep-2和HUVEC的增殖(P<0.05,P<0.01),呈剂量-时间依赖性;②Hep-2与HUVEC药物作用组均呈凋亡改变;③RT-PCR结果,药物作用组中survivin基因表达受到部分抑制(P<0.01);④内皮抑素能抑制新生血管的形成,并能破坏新生的血管网。结论内皮抑素可能通过诱导Hep-2和HUVEC的凋亡抑制其增殖,并能破坏新生的血管。内皮抑素可能以此抑制喉癌的生长与转移。     

内皮抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的评价脂质体介导的内皮抑素(ES)基因转移抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管的效果。探讨基因转移抑制视网膜新生血管的可行性。方法制备阳离子脂质体及PCDNA3ES复合物。选1周龄C57Bl/6N小鼠置于氧浓度为(75±2)%的氧箱中5d。回到正常环境中诱导视网膜新生血管模型。在小鼠离开氧箱的当日,向ES注射组鼠玻璃体腔注射2μl脂质体PCDNA3ES复合物;载体对照组注射等量脂质体空白载体复合物;空白对照组小鼠注射等量PBS。采用ES抗体免疫组化方法检测ES蛋白在视网膜的表达;回到正常环境中后5d,采用荧光标记的右旋糖酐血管灌注下视网膜铺片方法观察视网膜新生血管的分布;组织学切片观察比较突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量;透射电镜观察ES转移对视网膜超微结构的影响。结果免疫组化检查发现ES注射组小鼠玻璃体腔注射ES后24h开始有ES表达,主要位于视网膜神经纤维层细胞中,维持至少2周仍见表达;视网膜铺片观察可见空白对照组在无灌注区边缘均可见新生血管芽及荧光渗漏。ES注射组见新生血管芽明显减少;组织学检查ES注射组较其他两组突破视网膜内界膜的细胞数量减少,差异有统计学意义;ES转移后电镜下视网膜各层超微结构未见明显改变。结论采用玻璃体腔注射方法行脂质体介导的内皮抑素基因转移可以一定程度抑制缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管生长,对视网膜无明显的毒副作用。应进一步优化转移条件以提高治疗效果。     

应用转基因技术体外培养表达内皮抑素的Brown Norway大鼠视网膜色素上皮细胞

目的应用转基因技术体外培养稳定表达人内皮抑素的视网膜色素上皮(RPE)细胞,为脉络膜新生血管(CNV)基因治疗奠定基础。方法采用人内皮抑素真核表达载体pSecT agA-h内皮抑素,应用电转移法及脂质体介导法转染B row n N orw ay(BN)大鼠RPE细胞,以平阳霉素筛选出表达内皮抑素的RPE细胞,传代培养3周。转染后提取RPE细胞总DNA,聚合酶链反应(PCR)产物琼脂糖凝胶电泳,原位杂交,蛋白印记和免疫组织化学观察内皮抑素在转染RPE细胞中的表达情况;酶联免疫吸附试验(EL ISA)检测转染RPE细胞培养上清液中内皮抑素的表达水平;四甲基偶氮唑蓝比色法(M TT)测定所表达内皮抑素蛋白活性。结果PCR检测结果表明转染后的RPE细胞总DNA中存在长度为550碱基对左右的特异性条带;原位杂交,免疫组织化学观察到大量RPE细胞表达内皮抑素mRNA及内皮抑素蛋白;蛋白印记显示,RPE细胞裂解产物中有内皮抑素阳性条带;EL ISA法检测到转染后3、5、7、10、14、20 d 6个时间点培养上清液内皮抑素蛋白表达量分别为(321.5±41.0)、(162.5±23.45)、(78±11.22)、(78±9.87)、(78±10.06)、(78±12.67)ng/m l;M TT显示,培养上清液中内皮抑素能够抑制脐静脉内皮细胞304的增生,IC 50为45.68μg/m l,对RPE细胞、K 562的生长无影响。结论经电转移法及脂质体介导转染法获得体外培养稳定表达内皮抑素的RPE细胞是可行的,转染成功的RPE细胞能够稳定表达内皮抑素蛋白,所表达的内皮抑素蛋白具有生物活性。     

重组人血管内皮抑素对鼠血管瘤内皮细胞株EOMA增殖的影响

目的 研究重组人血管内皮抑素(YH-16,恩度)对鼠源性血管瘤内皮细胞(EOMA)的抑制作用及其机制,并与血管瘤常用药物曲安缩松、平阳霉素(PYM)、干扰素α-2a相比较,观察单用及联合用药对EOMA细胞的抑制作用.方法 用MTT法检测不同浓度的YH-16对EOMA细胞作用24、48、72 h的抑制率,筛选出YH-16的最适抑制浓度.比较YH-16、曲安缩松、PYM、干扰素α2a四种药物单用以及YH-16、曲安缩松、平阳霉素两两联合作用对EOMA细胞的抑制率.采取流式细胞术测定YH-16作用EOMA细胞48h后,细胞凋亡率及Caspase-3的活性.结果 ①YH-16各浓度组在24h、48 h及72 h三个作用时段对EOMA细胞抑制作用显著(P＜0.01),并存在明显的剂量依赖关系;②选择200 gg/ml为YH-16的最适抑制浓度;③四种药物抑制作用由强到弱:PYM＞YH-16＞曲安缩松＞干扰素α-2a;④YH-16与曲安缩松或与PYM的联合效应均为拮抗效应,Q值均＜0.85;PYM与曲安缩松的联合效应为相加效应,0.85＜Q值＜1.15;⑤YH-16作用后细胞凋亡率随药物浓度增加而增高,Caspase-3表达在YH-16各浓度组均增强(P＜0.01).结论 YH-16对EOMA细胞有确切的抑制作用.该作用弱于PYM,而强于曲安缩松及干扰素α-2a,它主要是通过诱导细胞凋亡实现,且Caspase-3参与此过程.YH-16能拮抗曲安缩松及PYM抑制EOMA细胞增殖的作用,曲安缩松能增加PYM对EOMA的抑制增殖作用.     

白细胞介素18与内皮抑素联合基因导入治疗肿瘤的研究

目的选用白细胞介素18(IL-18)和内皮抑素(ES)联合以物理方法导入治疗肿瘤,以探索一种肿瘤基因治疗的新途径。方法①采用脂质体包被肌肉注射法将作者构建的质粒pSecTag2B- mIL-18和pES1424-mES分别和联合转入Balb/c小鼠,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两种基因蛋白在动物体内的表达情况;②将小鼠分为4组:pSecTag2B-mIL-18转入组、pES1424-mES转入组、pSecTag2B-mlL-18与pES1424-mES联合转入组和对照组,观察各组肿瘤的生长情况。结果①RT-PCR和ELISA检测证明两种质粒均能够在小鼠肌肉中表达,特别是将两种质粒同时转入同一小鼠肌肉后,能够同时在小鼠肌肉中表达;并将表达的蛋白分泌到外周血液循环中,分泌量与单独基因转入分泌表达量的差异没有统计学意义。②IL-18、ES单独应用都能明显抑制肿瘤的生长,而两基因联合治疗抑制肿瘤的效果明显好于单基因治疗组。结论联合IL-18和ES基因治疗比两种基因单独应用能够更好地抑制肿瘤生长。     

内皮抑素通过Notch1/血小板源生长因子信号通路对小鼠肺纤维化的抑制作用

目的研究内皮抑素通过Notch1/血小板源生长因子（Notch1/PDGF）信号通路对小鼠肺纤维化的抑制作用。 方法将30只小鼠分为对照组、模型组和内皮抑素组,每组各10只。模型组和内皮抑素组小鼠给予气管内注射博莱霉素（5 mg/kg）以建立肺纤维化模型,对照组小鼠仅注射等量等渗NaCl溶液;内皮抑素组小鼠每天腹腔注射内皮抑素（2.3 mg/kg）,对照组和模型组小鼠每天腹腔注射等量等渗NaCl溶液,所有小鼠均持续注射21 d。21 d后处死所有小鼠,取左肺组织行病理学染色;取右肺组织,应用Western-blotting法检测Collagen I,Notch1/PDGF信号通路相关蛋白转化生长因子β1（TGF-β1）、Hes1、Hey1、PDGF-B、PDGF受体β（PDGFR-β）及周细胞相关蛋白Desmin、神经元-胶质细胞抗原2（NG2）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。 结果光镜下,可见对照组小鼠肺泡结构完整,未见异常胶原蛋白;模型组小鼠肺泡结构被破坏,有大量胶原蛋白沉积;内皮抑素组小鼠可见肺组织结构相对完整,而胶原蛋白明显减少。3组小鼠间Collagen I、TGF-β1、Hes1、Hey1、PDGF-B、PDGFR-β、Desmin、NG2及α-SMA蛋白表达水平的比较,差异均有统计学意义（F = 12.068、30.603、29.757、35.451、16.059、16.420、24.512、19.084、28.102,P均<0.001）。进一步两两比较发现,内皮抑素组小鼠的Collagen I、TGF-β1、Hes1、Hey1、PDGF-B、PDGFR-β及α-SMA蛋白表达水平均显著低于模型组小鼠,Desmin及NG2蛋白表达水平均显著高于模型组小鼠（P均<0.05）;而内皮抑素组与对照组小鼠间Collagen I、TGF-β1、Hes1、Hey1、PDGF-B、PDGFR-β、Desmin、NG2及α-SMA蛋白表达水平的比较,差异均无统计学意义（P均>0.05）。 结论内皮抑素可通过Notch1/PDGF信号通路抑制周细胞向肌成纤维细胞转化,从而影响小鼠肺纤维化。     

Expression of b‐FGF and endostatin and their clinical significance in human osteosarcoma

Objective: To investigate the expression and the clinical significance of basic fibroblast growth factor (b‐FGF) and endostatin in osteosarcoma. Methods: From January 2003 to December 2005, expression of b‐FGF, endostatin and CD34 were detected in 30 osteosarcoma and 30 osteochondroma tissue specimens by the immunohistochemical Elivision method. All data were post‐processed with SPSS 13.0 software and prepared for investigation and analysis of these expressions and the relationships between the parameters. Results: (i) The rates of expression of b‐FGF, endostatin and CD34 protein in osteosarcoma were 76.7%, 93.3%, and 96.7%, respectively, and in osteochondroma 43.3%, 40.0% and 16.7%, respectively. Each of the three expressions showed obvious differences between the osteosarcoma and the osteochondroma group. (ii) In the osteosarcoma group, expression of endostatin was positively correlated with that of CD34 (P < 0.05, γs = 0.528), and expression of endostatin in poorly differentiated osteosarcoma was much greater than that in highly differentiated osteosarcoma (P= 0.004). Expression of endostatin correlated with osteosarcoma metastasis (P= 0.036). (iii) There was no correlation between b‐FGF and endostatin expression rates (P= 0.182) in the osteosarcoma group. Conclusion: Angiogenesis is the basis of tumor metastasis, as well as being an important factor in tumor growth. Expression of endostatin could be adopted as a parameter for the diagnosis of postoperative metastases and for assessing prognosis, and could act as an adjuvant indicator in the grading of osteosarcoma.     

肝癌患者血清血管内皮生长因子和内皮抑素水平的变化及意义

目的 研究肝癌患者血清血管内皮生长因子(VEGF)和内皮抑素(endostatin)的动态变化规律及其与临床病理特征的关系.方法 用ELISA法检测163例原发性肝癌患者(肝癌组)血清VEGF和内皮抑素水平,并与慢性乙型肝炎肝硬化(肝硬化组)和健康人群(正常对照组)做对比.另外,比较117例行外科手术和(或)介入手术的原发性肝癌患者术前及术后2周VEGF和内皮抑素水平的变化.结果 肝癌组患者血清VEGF和内皮抑素水平显著高于肝硬化组和正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);术后2周血清VEGF水平较术前均显著下降,而血清内皮抑素水平较术前显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01).肝癌患者血清VEGF、内皮抑素水平与肿瘤大小、有无门静脉癌栓及临床分期密切相关(P＜0.01),而与性别、是否合并肝硬化无相关性(P＞0.05).肝癌组患者术前内皮抑素水平与VEGF水平呈正相关(r=0.658,P＜0.01).结论 肝癌患者血清VEGF和内皮抑素水平升高,且与肿瘤大小及临床分期密切相关,可作为诊断和评价肝癌发生、发展的指标.