分泌人内皮抑素的微囊化基因工程细胞系的构建

目的 建立能稳定分泌人内皮抑素(hES)的基因工程细胞系,观察内皮抑素(ES)蛋白和hES的表达.方法 以hES重组质粒pcDNA3.0(pcDNA3-Endo)为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得hES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体绿色荧光蛋白(pEGFP-N1)质粒中,获得重组质粒pEGFP-N1-Es;利用阳离子脂质体介导将其转染到人胚胎肾细胞(HeK-293)细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hES/293,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测转染细胞上清中ES蛋白的表达;用海澡酸钠壳聚糖(ACA)微囊包裹hES/293细胞,分别收集培养3、7、21、35 d的ACA微囊化hES/293细胞的培养上清液,Western blot法检测包裹后培养液上清中hES的表达.结果 重组质粒pEGFP-N1-ES经限制性核对内切酶HindⅢ和限制性核酸内切酶BamH Ⅰ双酶切得到4700碱基对(bp)和600 bp 2条带;PCR扩增出600 bp条带;测序结果与NCBI上序列比对软件(BLAST)比对,同源性达到100%.pEGFP-N1-ES转染HeK-293细胞,经G418筛选后获得阳性克隆,选取筛选的10株单克隆细胞培养上清液进行Western blot分析,在相对分子质量为20×103处出现蛋白条带.在ACA微囊内hES/293细胞随着培养时间的延长,细胞团逐渐长大,充满整个囊内空间.培养3、7、21、35 d时,在相对分子质量为20×103处出现蛋白条带.结论 重组pEGFP-N1-ES真核表达载体构建正确,转染HeK-293细胞后可有效的表达hES蛋白,并能分泌到细胞外;微囊化hES/293细胞产生的ES蛋白可以自由扩散出微囊膜外,并呈持续性表达.     

肾透明细胞癌患者血清中内皮抑素含量检测及其临床意义

目的 检测肾透明细胞癌患者术前血清中内皮抑素含量,分析其与肿瘤分级、分期的关系.方法 2004年3月至2008年10月接受手术治疗的肾透明细胞癌患者138例,其中男性102例,女性36例,平均年龄63.2岁;T1期73例,T2期39例,T3期20例,T4期6例.40例性别、年龄相应的健康人作为对照组,应用双抗体夹心ELISA法检测其术前血清中内皮抑素水平.结果 患者术前血清中内皮抑素含量均值为93.1 μg/L,与健康对照组(78.9 μg/L)差异无统计学意义(P>0.05).T1期患者术前血清内皮抑素水平为80.4 μg/L,低于T2期(107.5 μg/L,P<0.01)、T3期(102.7 μg/L,P<0.05)及T4期(120.7 μg/L,P<0.01),而后三组之间差异无统计学意义(P>0.05).T1期患者与对照组无明显差异(P>0.05).转移组患者术前血清内皮抑素含量为118.4 μg/L,高于未转移组的89.5 μg/L(P<0.05);单纯淋巴结转移组及远处转移组患者之间差异无统计学意义.G3-4级患者血清内皮抑素水平为111.8 μg/L,高于G1级(80.4 μg/L)和G2级(86.2 μg/L)(P<0.01).结论 肾透明细胞癌患者术前血清内皮抑素含量与肿瘤的高分级、高分期相关,可能有助于患者预后及肿瘤分化程度判断.     

内皮抑素通过Notch1/血小板源生长因子信号通路对小鼠肺纤维化的抑制作用

目的研究内皮抑素通过Notch1/血小板源生长因子（Notch1/PDGF）信号通路对小鼠肺纤维化的抑制作用。 方法将30只小鼠分为对照组、模型组和内皮抑素组,每组各10只。模型组和内皮抑素组小鼠给予气管内注射博莱霉素（5 mg/kg）以建立肺纤维化模型,对照组小鼠仅注射等量等渗NaCl溶液;内皮抑素组小鼠每天腹腔注射内皮抑素（2.3 mg/kg）,对照组和模型组小鼠每天腹腔注射等量等渗NaCl溶液,所有小鼠均持续注射21 d。21 d后处死所有小鼠,取左肺组织行病理学染色;取右肺组织,应用Western-blotting法检测Collagen I,Notch1/PDGF信号通路相关蛋白转化生长因子β1（TGF-β1）、Hes1、Hey1、PDGF-B、PDGF受体β（PDGFR-β）及周细胞相关蛋白Desmin、神经元-胶质细胞抗原2（NG2）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。 结果光镜下,可见对照组小鼠肺泡结构完整,未见异常胶原蛋白;模型组小鼠肺泡结构被破坏,有大量胶原蛋白沉积;内皮抑素组小鼠可见肺组织结构相对完整,而胶原蛋白明显减少。3组小鼠间Collagen I、TGF-β1、Hes1、Hey1、PDGF-B、PDGFR-β、Desmin、NG2及α-SMA蛋白表达水平的比较,差异均有统计学意义（F = 12.068、30.603、29.757、35.451、16.059、16.420、24.512、19.084、28.102,P均<0.001）。进一步两两比较发现,内皮抑素组小鼠的Collagen I、TGF-β1、Hes1、Hey1、PDGF-B、PDGFR-β及α-SMA蛋白表达水平均显著低于模型组小鼠,Desmin及NG2蛋白表达水平均显著高于模型组小鼠（P均<0.05）;而内皮抑素组与对照组小鼠间Collagen I、TGF-β1、Hes1、Hey1、PDGF-B、PDGFR-β、Desmin、NG2及α-SMA蛋白表达水平的比较,差异均无统计学意义（P均>0.05）。 结论内皮抑素可通过Notch1/PDGF信号通路抑制周细胞向肌成纤维细胞转化,从而影响小鼠肺纤维化。     

抗新生血管形成基因治疗胶质瘤的实验研究

目的:探讨Endostatin基因(EScDNA)对大鼠胶质瘤的抑制作用。方法:采用脂质体法将pSecTagA-ES-cDNA和pSecTagA转染人脐静脉内皮细胞(EVC-304),并以 RT-PCR、Western Blot分别从RNA水平和蛋白水平鉴定转染是否成功。然后以 FCM测细胞凋亡情况,MTT实验测细胞活力,验证Endostatin基因对血管内皮细胞增殖的抑制作用。再以C_6胶质瘤细胞植于SD大鼠腋部皮下制作胶质瘤模型。将pSecTagA-EScDNA直接瘤内注射。分别观察记录肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。结果:转染细胞PCR、Western分别检测到EScDNA和ES;FCM示细胞凋亡增加,MTT示细胞活力降低,肿瘤生长曲线示肿瘤生长明显受抑。说明Endostatin基因体内应用,具有明显抑制C_6胶质瘤的效应。结论:Endostin基因可能通过抑制肿瘤血管新生从而对胶质瘤达到抑制作用,为临床抗血管形成基因治疗胶质瘤提供了实验依据。     

内皮抑素联合异环磷酰胺对小鼠肉瘤血管生成及肿瘤生长的抑制作用

目的:观察内皮抑素(endostatin,ES)联合异环磷酰胺(ifosfamide,IFO)对小鼠肉瘤皮下移植模型中肿瘤血管生成和肿瘤生长的抑制作用.方法:建立小鼠肉瘤模型,随机将60只荷瘤小鼠分为对照组、ES组、IFO组和ES+IFO联合用药组,分别给予相应药物,观察肿瘤生长情况,计算抑瘤率,并且采用免疫组织化学法检测肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD).动物处死前1 min于尾静脉注射DiOC7(3),荧光显微镜下观察肿瘤组织灌注血管标记,计算灌注血管平均距离.结果:各治疗组药物均能明显抑制肿瘤的增长,ES组、IFO组和ES+IFO组的抑瘤率分别为43.13%、76.57%和84.66%,联合用药组的抑瘤作用最为显著(P<0.05).对照组、ES组、IFO组与ES+IFO联合用药组的移植瘤组织MVD分别为(43.13±9.86)、(17.87±7.69)、(29.20±9.28)及(7.60±3.18)个/400 Hp,灌注血管平均距离分别为(43.33±8.21)、(84.94±6.99)、(68.96±10.90)及(121.08±22.75)μm,联合用药组的MVD和灌注血管平均距离与单一用药组及对照组相比的差异有统计学意义(P<0.05).结论:ES联合IFO治疗肉瘤时,可通过显著抑制结构血管和灌注血管生成来抑制肿瘤生长,联合用药效果优于单一用药,二者具有协同抗肿瘤作用.     

应用基因表达谱芯片研究内皮抑素作用后人脐静脉内皮细胞株基因表达的变化

目的 观察人脐静脉内皮细胞株(ECV304细胞)在内皮抑素(ES)作用前后基因表达谱的变化,并探讨其作用的分子机制.方法 ES处理培养的ECV304细胞36 h,抽提ES作用前后细胞mRNA,用Cy3和Cy5不同的荧光标记脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)逆转录制备cDNA探针,与载有4096条基因的基因芯片进行杂交,通过对Cy3、Cy5荧光信号扫描后,分析经ES处理前后基因水平表达差异.结果 ES处理后细胞增生减慢,抽提RNA电泳18S、28S条带清晰,吸光度[A,旧称光密度(OD)]值为2.0～2.2.芯片扫描显示5.96%的检测基因出现明显表达差异,其中下调基因225条,上调基因19条.结论 ECV304细胞经ES作用后部分基因表达呈下凋趋势,可能与ES抑制新生血管生成机制有关.     

Expression of b‐FGF and endostatin and their clinical significance in human osteosarcoma

Objective: To investigate the expression and the clinical significance of basic fibroblast growth factor (b‐FGF) and endostatin in osteosarcoma. Methods: From January 2003 to December 2005, expression of b‐FGF, endostatin and CD34 were detected in 30 osteosarcoma and 30 osteochondroma tissue specimens by the immunohistochemical Elivision method. All data were post‐processed with SPSS 13.0 software and prepared for investigation and analysis of these expressions and the relationships between the parameters. Results: (i) The rates of expression of b‐FGF, endostatin and CD34 protein in osteosarcoma were 76.7%, 93.3%, and 96.7%, respectively, and in osteochondroma 43.3%, 40.0% and 16.7%, respectively. Each of the three expressions showed obvious differences between the osteosarcoma and the osteochondroma group. (ii) In the osteosarcoma group, expression of endostatin was positively correlated with that of CD34 (P < 0.05, γs = 0.528), and expression of endostatin in poorly differentiated osteosarcoma was much greater than that in highly differentiated osteosarcoma (P= 0.004). Expression of endostatin correlated with osteosarcoma metastasis (P= 0.036). (iii) There was no correlation between b‐FGF and endostatin expression rates (P= 0.182) in the osteosarcoma group. Conclusion: Angiogenesis is the basis of tumor metastasis, as well as being an important factor in tumor growth. Expression of endostatin could be adopted as a parameter for the diagnosis of postoperative metastases and for assessing prognosis, and could act as an adjuvant indicator in the grading of osteosarcoma.     

携带人Endostatin基因的腺病毒治疗胰腺癌移植瘤

目的 观察携带人Endostatin基因的重组腺病毒载体Ad-hEnd对裸鼠胰腺癌移植瘤的治疗作用.方法 将胰腺癌细胞株SW1990细胞皮下注射建立裸鼠移植瘤模型,随机分为Ad-hEnd组、报告基因LacZ重组腺病毒组(Ad-LacZ组)和对照组,每组8只.重组腺病毒200 μl瘤内注射,隔日1次,共4次.观察移植瘤的生长情况,免疫组化染色检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达和微血管密度(MVD),原位缺口末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡.结果 移植瘤成瘤率100%.治疗后4周,Ad-hEnd组、Ad-LacZ组和对照组移植瘤体积分别为(921.9±279.7)mm3、(2804.4±553.5)mm3和(3040.6±487.6)mm3;瘤重分别为(1.19±0.18)g、(2.38±0.42)g和(2.41±0.47)g;VEGF表达阳性率分别为(36.3±7.1)%、(81.2±6.6)%和(79.4±6.2)%;MVD分别为12±4、27±5和25±6;细胞凋亡率分别为(31.2±5.4)%、(9.4±4.9)%和(8.5±3.7)%.与Ad-LacZ组和对照组比较,Ad-hEnd组以上各项指标均有显著性差异(P＜0.01);Ad-LacZ组和对照组之间的差异无统计学意义.结论 重组腺病毒介导的hEndostatin基因可抑制胰腺癌的生长和血管生成,促进肿瘤细胞凋亡,可用于胰腺癌抗血管生成的基因治疗.     

重组人内抑素对佐剂关节炎大鼠血清中肿瘤坏死因子-a、白细胞介素-6和瘦素表达水平的影响

目的研究重组人内抑素(endostatin,ES)对大鼠佐剂关节炎(AA)血清中TNF-a(肿瘤坏死因子-a)IL-6(白细胞介素-6)以及Leptin(瘦素)表达水平的影响,以探讨ES对AA的治疗作用。方法给大鼠右后足跖部皮内注射完全弗氏佐剂(CFA)建立AA模型。在致炎后第10天,大鼠继发性关节炎出现,开始在治疗组AA大鼠皮下注射内抑素2.5 mg/kg,连续7 d。直至第24天大鼠足爪肿胀度的抑制有显著性时,用放免法(RIA)测定大鼠血清中TNF-aI、L-6及Leptin的表达水平。结果治疗组AA大鼠血清中TNF-aI、L-6、Leptin水平低于造模组,血清中Leptin的表达水平与TNF-aI、L-6呈显著正相关。结论重组人内抑素对大鼠佐剂关节炎的继发炎症有明显抑制作用。治疗组血清中Leptin的表达水平与TNF-aI、L-6呈显著正相关。     

肝癌患者血清血管内皮生长因子和内皮抑素水平的变化及意义

目的 研究肝癌患者血清血管内皮生长因子(VEGF)和内皮抑素(endostatin)的动态变化规律及其与临床病理特征的关系.方法 用ELISA法检测163例原发性肝癌患者(肝癌组)血清VEGF和内皮抑素水平,并与慢性乙型肝炎肝硬化(肝硬化组)和健康人群(正常对照组)做对比.另外,比较117例行外科手术和(或)介入手术的原发性肝癌患者术前及术后2周VEGF和内皮抑素水平的变化.结果 肝癌组患者血清VEGF和内皮抑素水平显著高于肝硬化组和正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);术后2周血清VEGF水平较术前均显著下降,而血清内皮抑素水平较术前显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01).肝癌患者血清VEGF、内皮抑素水平与肿瘤大小、有无门静脉癌栓及临床分期密切相关(P＜0.01),而与性别、是否合并肝硬化无相关性(P＞0.05).肝癌组患者术前内皮抑素水平与VEGF水平呈正相关(r=0.658,P＜0.01).结论 肝癌患者血清VEGF和内皮抑素水平升高,且与肿瘤大小及临床分期密切相关,可作为诊断和评价肝癌发生、发展的指标.