胶原诱导关节炎大鼠滑膜中血管内皮生长因子和内皮抑素的表达及意义

目的观察血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、内皮抑素（endostatin）在胶原诱导关节炎（CIA）大鼠不同时期滑膜中的蛋白表达，通过CD34给血管密度计数．明确生长因子在血管翳形成中的作用机制。方法建立CIA大鼠模型，测量关节体积，计算关节病理积分，并用免疫组织化学染色检测VEGF、bFGF、endostatin和CD34的蛋白表达。结果模型组大鼠滑膜VEGF和bFGF表达明显高于正常组大鼠（P〈0．01），并且二者表达存在相关性（P〈0．01），内皮抑素表达模型组与正常组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论滑膜中生长因子表达失衡在关节炎的形成及发展过程中起重要作用，促血管生长因子表达升高是导致滑膜新生血管形成的主要原因。     

雷公藤甲素对胶原诱导关节炎大鼠滑膜血管新生的调节作用

目的 观察雷公藤甲素(TP)对血管新生的影响,探讨TP治疗关节炎的作用机制.方法 建立胶原诱导关节炎(CIA)大鼠模型,常规苏木素-伊红(HE)染色,测量关节体积,计算关节炎指数和病理积分,分别检测滑膜和血清中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮抑素(endostatin)的蛋白表达,并通过CD34给滑膜血管密度计数(MVD).结果 CIA大鼠滑膜和血清中VEGF、bFGF及滑膜MVD明显高于正常组(X2分别为65.3、31.6,q=9.2,三者P＜0.01),endostatin的表达与正常组差异无统计学意义(X2=0.8,P＞0.05).TP治疗后,滑膜和血清中VEGF、bFGF、滑膜MVD均下降(X2分别为19.7、6.0,q=6.5,三者P＜0.01),而endostatin表达却升高(X2=3.9,P＜O.05),甲氨蝶呤(MTX)则主要以endostatin表达升高为主(X2=17.9,P＜0.01).结论 生长因子的表达失衡可能在关节炎的形成及发展过程中起重要作用,TP能够调整生长因子的失衡状态而发挥治疗作用.     

重组人内皮抑素对尿毒症腹膜透析大鼠腹膜新生血管形成的影响

目的 研究重组人内皮抑素对尿毒症腹膜透析（PD）大鼠腹膜新生血管形成的影响。 方法 40只雄性SD大鼠,按随机数字表法分为正常对照组、肾衰竭非透析组、4.25%PD组、重组人内皮抑素10 mg/kg PD组、重组人内皮抑素40 mg/kg PD组,每组8只。对PD组规律PD 28 d。重组人内皮抑素干预组在行规律PD期间,隔天1次皮下注射重组人内皮抑素,至透析第28天结束。28 d后取各组大鼠新鲜腹膜组织,RT-PCR法检测腹膜组织血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） mRNA表达;免疫组化染色检测VEGF、bFGF蛋白表达。CD34染色观察腹膜组织毛细血管密度（MVD）。 结果 各组大鼠腹膜组织均表达VEGF和bFGF,肾衰竭非透析组、4.25%PD组VEGF及bFGF mRNA、蛋白表达均显著高于正常对照组（均P < 0.05）;重组人内皮抑素10 mg/kg PD组、40 mg/kg PD组VEGF及bFGF mRNA、蛋白表达均显著低于4.25%PD组（均P < 0.05）。肾衰竭非透析组、4.25%PD组腹膜组织MVD均显著高于正常对照组（均P < 0.05）;重组人内皮抑素10 mg/kg、40 mg/kg PD组腹膜组织MVD均显著低于正常对照组（均P < 0.05）。 结论 重组人内皮抑素可以有效抑制PD大鼠腹膜新生血管的形成,下调VEGF、bFGF mRNA及蛋白表达可能是其抑制腹膜新生血管形成的机制之一。     

内皮抑素基因转移抑制血管内皮细胞增殖的实验研究

目的　探讨脂质体介导的内皮抑素 (ES)基因转移抑制血管内皮细胞增殖的可行性及ES基因转移对血管内皮细胞增殖的影响。方法　利用阳离子脂质体介导的分泌型真核细胞表达载体PCDNA3 ES转染COS 7细胞 ,并采用免疫斑点杂交法检测转染细胞及其上清液中ES蛋白的表达 ;以脂质体介导的PCDNA3 ES转染培养的人脐静脉血管内皮细胞 (ECV 30 4细胞 ) ,免疫组化染色观察ES蛋白的表达 ;应用噻唑蓝染色法 (MTT)观察脂质体介导的ES基因转移并抑制ECV 30 4细胞增殖的作用 ;以流式细胞仪检测ES基因转染后对细胞增殖周期的影响。结果　重组质粒转染的COS 7细胞及其上清液中均有明显的斑点出现 ,而以载体质粒转染的细胞则无斑点出现 ;脂质体介导的ES基因成功转染ECV 30 4细胞 ,转染后 2d ,ES蛋白表达量达到高峰 ;ES基因转移可以明显抑制血管内皮细胞增殖 ,同一观察时间转染与非转染组比较 ,差异有非常显著意义 (P <0 0 1) ;ES基因转染组G0 /G1细胞比例增加 ,S期细胞比例减少。结论　脂质体介导ES基因可成功转染血管内皮细胞并有ES蛋白的分泌表达 ,从而特异性抑制血管内皮细胞的增殖。     

脂质体介导内皮抑素基因转移抑制兔角膜新生血管的研究

目的　探讨阳离子脂质体介导的内皮抑素 (ES)基因转移对角膜新生血管的抑制作用。方法　新西兰大白兔 30只,角膜缝线法制作角膜新生血管模型,按随机数字表法随机分为A、B、C3组。A组:缝线后立即于上方近角膜缘处结膜下注射 150μl阳离子脂质体与ES重组质粒 (含质粒 20μg)的混合液;B组:同样部位注射 150μl阳离子脂质体与空白质粒(含质粒 20μg)的混合液;C组:同样部位注射 150μl生理盐水。分别于缝线后 3、7、14、21和 28d在裂隙灯显微镜下观察各组角膜新生血管的生长情况,并计算角膜新生血管的面积。通过免疫组化方法检测各时相角膜缘及角膜组织中ES目的基因的表达情况。结果　A组角膜新生血管的出现时间为 ( 6 85±0 69 )d,B组为(3 43±0 53)d,C组为(3 14±0 69)d, 3组间比较差异有统计学意义 (F=100 24, P<0 05 ),A组明显晚于其他两组;在缝线后 14、21、28d,A组角膜新生血管的面积均明显小于其他两组,差异有统计学意义(F=72 662, 75 601, 27 729; P均<0 05)。A组于各观察时相均可在上方角膜缘和角膜组织中发现ES阳性表达,以转染 3d时最为明显, 7d时阳性细胞着色有所变浅, 14d时阳性细胞数明显减少, 28d时只偶见阳性表达;各时相下方角膜及角膜缘组织均未见ES阳性表达。B、C两组各时相均未发现ES阳     

化疗与手术对肺癌患者血清endostatin水平影响的初步观察

目的:探讨肺癌患者化疗与手术前后血清内皮抑素(endostatin)水平的变化及临床意义。方法:用ELISA法检测20例良性肺部疾病患者和20例健康人及60例肺癌患者化疗和手术前后的血清endostatin水平,并作对比分析。结果:肺癌组血清endostatin水平明显高于良性肺部疾病组和健康人组(P<0.001),其水平与肿瘤大小有关,与组织学类型、临床分期无关。肺癌患者手术后7d血清endostatin水平明显低于手术前(P<0.001)。肺癌患者化疗受益组结束后3d血清内皮抑素水平明显高于化疗前和化疗结束后21d的水平(P<0.001)。结论:血清endostatin水平与肿瘤大小、手术及化疗有关。     

内皮抑素真核表达载体对移植性卵巢癌的抑制作用

目的探讨脂质体介导的内皮抑素真核表达载体对裸鼠移植性卵巢癌的抑制作用。方法利用已构建的内皮抑素真核表达载体pVAX1sEn,在脂质体介导下转染卵巢癌细胞系3AO细胞,RTPCR技术检测3AO细胞中内皮抑素mRNA的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测3AO细胞上清液中内皮抑素的水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3AO细胞上清液中的内皮抑素对脐静脉内皮细胞系ECV204细胞的抑制作用。将荷卵巢癌移植瘤裸鼠分为3组,pVAX1sEn治疗组、pVAX1对照组和生理盐水对照组,分别观察3组卵巢癌的生长情况。结果RTPCR技术检测结果显示,在610bp处有一内皮抑素mRNA的特异性条带;ELISA法检测结果显示,pVAX1sEn转染3AO细胞后其上清液中内皮抑素水平为(201±8)ng/ml;MTT法检测结果显示,pVAX1sEn转染3AO细胞后其上清液中的内皮抑素可有效抑制ECV204细胞的生长,最高抑制率为42%。pVAX1sEn治疗组肿瘤体积为(0.85±0.18)cm3,显著小于生理盐水对照组的(1.90±0.28)cm3和pVAX1对照组的(1.78±0.32)cm3(P<0.05)。肿瘤组织HE染色显示,pVAX1sEn治疗组肿瘤细胞坏死明显,而生理盐水对照组及pVAX1对照组肿瘤细胞生长旺盛。结论脂质体介导的pVAX1sEn瘤内注射可有效抑制卵巢癌移植瘤的生长。     

内皮抑素和血管生成抑素融合基因修饰的单纯疱疹病毒对胶质瘤干细胞的体外实验研究

目的 探讨内皮抑素和血管生成抑素( Endo - Angio)融合基因修饰的单纯疱疹病毒(VAE)对胶质瘤干细胞(GSCs)的体外溶瘤作用。方法 新鲜高级别（WHOⅢ级、Ⅵ级）人脑胶质瘤标本经原代培养获得GSCs,采用流式细胞术检测其中CD133阳性细胞数,单克隆形成实验检测GSCs的自我更新能力,免疫荧光技术检测未分化GSCs的Nestin及分化后GFAP、NF和MAG的表达;MTS法检测VAE对GSCs增殖活性的影响,RT - PCR和Western blot检测Endo - Angio融合蛋白的表达并检测其对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)增殖的影响;最后观察病毒处理后仍存活细胞的自我更新和诱导贴壁情况。结果 (1)从20例高级别胶质瘤标本中培养出4例GSCs,能够表达CD133及Nestin,具有自我更新能力和多向分化能力。(2)VAE能够感染GSCs,4例GSCs增殖活性明显下降(P＜0.05)。(3)VAE感染GSCs 48 h后,基因水平及蛋白水平都有Endo- Angio融合蛋白表达,该融合蛋白使HBMEC增殖活性明显下降(P＜0.05)。(4)VAE感染后仍存活的细胞不再具有形成GSCs球的能力,加入血清诱导后也不再贴壁生长。结论 在体外,VAE能够显著抑制GSCs活性,能够表达具有生物活性的Endo-Angio融合蛋白,为脑胶质瘤溶瘤病毒治疗开辟了新的途径。     

重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素基因治疗裸鼠子宫内膜异位症

目的 研究重组腺相关病毒介导的人血管内皮抑素(endostatin)基因对子宫内膜异位症(内异症)裸鼠模型的治疗作用.方法 构建携带人血管内皮抑素基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组腺相关病毒载体rAAV2-endostatin-EGFP,,将2008年11-12月在天津医科大学第二医院妇科因子宫肌瘤行子宫全切除术的12例患者的子宫内膜种植于60只裸鼠的盆腹腔内,建立内异症裸鼠模型,1周后分为3组:治疗组20只,于异位病灶局部直接注射rAAV2-endostatin-EGFP;阴性对照组20只,于病灶局部直接注射空白载体rAAV2-EGFP;空白对照组20只,于病灶局部直接注射等体积的磷酸盐缓冲液.分别于给药后1、2、3周各开腹1次,观察裸鼠盆腹腔病灶,同时留取异位病灶组织,检测各组裸鼠异位病灶中人血管内皮抑素蛋白表达情况、腺体数、微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况;于给药后3周检测各组裸鼠血清中雌二醇、孕酮水平.结果(1)采用腹膜种植法建立内异症裸鼠模型,种植成功率达100%.给药1周后,治疗组裸鼠异位病灶平坦、中央下陷,光镜下可见腺体数减少,腺腔变窄,细胞稀疏、呈萎缩状态.(2)荧光显微镜下观察,给药后1、2、3周,治疗组裸鼠异位病灶组织腺体和间质内出现绿色荧光;而阴性对照组和空白对照组裸鼠异位病灶组织内未见绿色荧光.(3)各组裸鼠给药后1、2、3周的异位病灶内腺体数,治疗组分别为(7.8±1.9)、(7.0±1.5)和(5.5±1.7)个,均低于阴性对照组[分别为(10.1±1.7)、(10.2±2.0)和(9.8±2.4)个]和空白对照组[分别为(10.2±2.2)、(10.0±2.0)和(9.7±2.2)个],差异均有统计学意义(P<0.05);治疗组裸鼠给药后1、2、3周的异位病灶内腺体数比较,差异也有统计学意义(P<0.05).(4)各组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶内的MVD,治疗组分别为(12.2±1.5)、(11.4±2.1)、(9.0±1.4)条,均低于阴性对照组[分别为(16.5±1.7)、(16.5±1.9)、(16.9±1.9)条]和空白对照组[分别为(16.2±1.6)、(16.0±1.6)、(16.3±1.7)条],差异均有统计学意义(P<0.05);治疗组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶内MVD比较,差异也有统计学意义(P<0.05).(5)各组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶中VEGF的阳性率及表达强度,治疗组分别为35%、30%、25%和1.60±0.43、1.33±0.30、1.03±0.36,均低于阴性对照组(分别为80%、75%、85%和2.43±0.53、2.43±0.29、2.66±0.45)和空白对照组(分别为85%、90%、90%和2.36±0.53、2.64±0.57、2.53±0.52),差异均有统计学意义(P<0.05);治疗组裸鼠给药后1、2、3周异位病灶中VEGF阳性率及表达强度比较,差异也有统计学意义(P<0.05).(6)给药后3周,治疗组裸鼠血清中的雌二醇、孕酮水平分别为(48±7)pmol/L、(61±8)nmol/L,分别与阴性对照组[分别为(50±9)pmol/L、(60±10)nmol/L]和空白对照组[分别为(48±7)pmol/L、(58±10)nmol/L]比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 携带人血管内皮抑素基因的重组腺相关病毒可抑制裸鼠内异症病灶的血管生成,从而抑制异位病灶的生长,而不影响体内生殖激素水平,抗血管生成基因治疗可能成为内异症治疗的新选择.     

微囊化内皮抑素球周注射的实验研究

目的 检测乳化.内部凝胶化制得的海藻酸钙.壳聚糖(CAC)内皮抑素微囊的体外释放情况,大鼠眼球周注射后眼内组织分布情况及生物相容性.方法 实验研究.采用乳化.内部凝胶化方式制备微囊,紫外分光光度法、考马斯亮蓝法检测内皮抑素囊外释放情况;32只SD大鼠随机分成4组,每组8只.A组:微囊化Es组,球周注射微囊化内皮抑素20 μl(2.5 g/L);B组:单纯内皮抑素组,球周注射内皮抑素蛋白20 μl(2.5 g/L);C组:空微囊组,球周注射空微囊20 μl;D组:生理盐水组,球周注射生理盐水20 μl.免疫组织化学法、ELISA法、Western-blot法检测内皮抑素分布、浓度和蛋白表达;观察SD大鼠的日常活动,进食情况和体重,以断颈法将大鼠处死取心、肝、脾、肺、肾及球周组织(球周注射部位周围组织)行病理学检查.采用独立样本设计定量资料t检验对数据进行分析.结果 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测可见内皮抑素蛋白条带,3、7、14、21 d各时点上清液中内皮抑素蛋白质浓度逐渐增加.A组:球周注射后7、14 d,内外核层和RPE层见内皮抑素蛋白阳性表达;B组:7 d时,以上组织可见内皮抑素蛋白阳性表达,14 d后无蛋白阳性表达;C组和D组7、14 d以上:组织均未见内皮抑素蛋白阳性表达,表明内皮抑素蛋白经CAC微囊化后通过球周注射可以穿过巩膜壁进入球内.A组7、14 d,眼球组织匀浆内皮抑素蛋白浓度分别为每只眼(63.16±7.64)μl和(33.2±5.77)μg/L,而B组分别为(33.2±2.89) μg/L,(15.73±2.08)μg/L,A组明显大于B组且差异具有统计学意义(t=6.364、4.920,P=0.003、0.008);大鼠日常活动和进食情况均正常,14 d后病理学检查心肝、脾、肺、肾及球周组织未见异常.结论 微囊化内皮抑素具有缓控释功能,球周注射微囊化内皮抑素,能穿过巩膜壁并分布在视网膜组织内,微囊对机体无明显毒副作用.