人骨髓间质干细胞定向分化为神经元样细胞的实验

目的：体外定向诱导人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞并观察其传导功能。方法：实验于2003-06／2004-02在中南大学湘雅医院完成。采用淋巴细胞分离液（1．007g／L）梯度离心分离人骨髓间质干细胞，体外进行培养扩增，丁化羟基苯甲醚和二甲基亚砜诱导人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞，免疫细胞化学方法鉴定神经元特异性标志物，神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白，突触素蛋白．胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白： 结果：加入诱导剂3h后，大多数细胞转变为类似于神经元的形态，有长的突起，相互之间连接呈网状，并表达神经元特异性烯醇化酶，阳性率为（75．0&;#177;6．5）％、神经丝蛋白阳性率为（68．0&;#177;4．2）％及胶质纤维酸性蛋白阳性率为（25．0&;#177;6．4）％，但胶质纤维酸性蛋白表达明显较前两者弱（P〈0．05）。神经元细胞胞体表达突触素蛋白，突起未见表达。 结论：人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞；神经元样细胞其突起不具备传导功能。     

兔骨髓源性神经干细胞分化为成熟神经元样细胞的特征研究

目的：探讨兔骨髓源性神经干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)经体外培养及诱导分化成的神经元样细胞，能否合成分泌5-羟色胺神经生物活性物质成分。方法：分离兔BMSCs，应用神经干细胞培养液和分化诱导因子进行体外培养和诱导分化，免疫细胞化学鉴定；并应用高效液相色谱法(HPLC)检测其5-羟色胺生物活性物质的含量。细胞培养所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)和维A酸。结果：BMSCs培养12d可见大而圆细胞，免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性；培养20d可见长突起神经元样细胞，神经核蛋白(NeuN)免疫细胞化学检查阳性，高效液相检测BMSCs、空白神经干细胞培养液及L-02肝细胞阴性对照组未测到5-羟色胺生物活性物质，经体外培养增殖14d的神经干细胞及培养液、体外诱导分化20d的神经元样细胞及培养液则可检测到5-羟色胺分别为：每1&;#215;10^7细胞中(1．7940&;#177;0．0095)，(4．010&;#177;0．1170)μg／L，差异有非常显著性意义(t=30．6323，P=0．001)。方差分析显示：随着骨髓基质细胞培养天数的增加，其所含的5-羟色胺浓度也渐增加，组间5-羟色胺含量差异有显著意义(P＜0．01)。结论：兔BMSCs能在体外增殖，并表达Nestin抗原；而且，在适宜条件下能分化成神经元样细胞，并表达成熟神经元特异性核蛋白，合成、分泌5-羟色胺神经递质。     

密度梯度离心法结合贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的:建立一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法,观察成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法:实验于2003-03/2004-05于哈尔滨医科大学组胚教研室完成。①用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞。②采用倒置显微镜、透射电镜观察,免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。③体外加成骨、成软骨诱导剂,14d分别做碱性磷酸酶组织化学、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察骨髓间充质干细胞的成骨分化及成软骨分化结果。结果:①成年大鼠骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,具有一般干细胞的超微结构特点。②广泛表达Vimentin,CD29,CD44,不表达CD14,CD34。③加入成骨诱导剂14d后,骨髓间充质干细胞呈多层重叠生长,现碱性磷酸酶强阳性,阳性率为90.5%。④经成软骨诱导后,Ⅱ型胶原免疫组化染色,诱导14d的骨髓间充质干细胞呈现广泛的棕褐色染色,在细胞密集处细胞周围可见黄褐色染色。结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化成年大鼠骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。     

应充分发挥传统方法在临床细菌学鉴定中的作用

微生物分析仪的使用加强了传统细菌学鉴定的薄弱环节，同时通过细菌形态、染色性等确认，保证了仪器鉴定的准确性。进十年来，随着检验医学的发展，临床细菌学检验日益受到重视，我们应充分发挥传统方法和先进仪器的优势促进临床细菌学检验技术的进一步提高。     

工频电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1 mRNA表达的刺激

背景:研究证实电磁场刺激能够促进多种骨生长因子的合成与分泌,而某些生长因子具有诱导骨髓间充质干细胞定向分化成骨的作用。目的:分析工频电磁场对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计:单一样本、区组设计,观察对比动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科。材料:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科实验室完成。①选取清洁级昆明种小鼠20只,作为实验用骨髓间充质干细胞的来源。②电磁场发生器由武汉市海军工程大学研制,能生成场强为0～100mT的连续可调的50Hz正弦波电磁场。③引物均由北京赛百胜生物工程公司合成。方法:①小鼠以颈椎脱臼法处死,取双侧股骨和胫骨,体外分离培养骨髓间充质干细胞,取第2代细胞用于实验。②不同强度电磁场刺激实验:设立阴性对照组、阳性对照组、电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组、阳性对照组均不给予电磁场刺激,但阳性对照组于传代时加入含成骨性诱导剂(含10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/LVitaminC)的培养基;电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组在细胞贴壁后分别于0.4,0.8,1.6mT场强中进行电磁场刺激,每天均连续刺激1h,5d后进行指标检测。③相同场强不同作用时间电磁场刺激实验:设立阴性对照组、电磁场1.6mT刺激15,30,60min组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组不进行电磁场刺激;电磁场1.6mT刺激15,30,60min组在1.6mT场强条件下每天分别给予15,30,60min的连续电磁场刺激,5d后进行指标检测。④RT-PCR技术检测各组细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。主要观察指标:①不同强度电磁场刺激对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。②相同场强不同作用时间电磁场刺激小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。结果:①电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,阳性对照组及电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2mRNA的表达达到最大值(57.74±0.23)%,电磁场0.4mT刺激组转化生长因子β1mRNA的表达达到最大值(126.20±0.21)%。②电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,电磁场1.6mT刺激15,30,60min组骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激60min组两种因子mRNA的表达分别达到最大值(28.06±0.11)%和(75.20±0.16)%。结论:适当强度及作用时间的工频电磁场刺激,能够明显促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。     

缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：观察缺血性脑血管病患者骨髓间充质干细胞形态学特征。方法：将缺血性脑血管病患者自体骨髓中的阃充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM—MSCs）经密度梯度离心法分离、纯化和培养，观察原代和传代细胞的形态。结果：原代培养的BM—MSCs最佳贴壁时间为3d，生长性状不一，呈散在圆形细胞群、散在梭形细胞群、克隆圆形细胞群、花带状细胞群、漩涡状细胞群，而传代培养的细胞，增殖速度较快，性状一致，排列规则，呈饱满的梭行。结论：通过体外非诱导培养获得的自体BM—MSCs，有较强的增殖能力和多向分化潜能，为缺血性脑血管病的临床治疗提供了实验依据。     

脑源性神经营养因子基因修饰人骨髓间充质干细胞有限细胞系的建立

目的：建立脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞系。方法：实验于2004—02／2005—06在解放军军事医学科学院干细胞研究中心完成。人类骨髓细胞来源于解放军三О七医院骨髓移植治疗的6名健康成年骨髓供者，男3名，女3名，年龄25-45岁。常规分离培养人骨髓间充质干细胞，流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面分子CD34、CD44、CD45，采用重组逆转录病毒载体将脑源性神经营养因子基因转入人骨髓间充质干细胞。检测脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的增殖特性，细胞内脑源性神经营养因子的蛋白表达，细胞培养液中脑源性神经营养因子含量，以及PCR检测脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞中外源性脑源性神经营养因子基因DNA。结果：①人工分离培养出的骨髓间充质干细胞，形态、大小一致，呈长梭型或长多边形，从P0至P20基本保持一致，P2代骨髓间充质干细胞表达基质细胞表面标志CD44，不表达造血系细胞表面标志CD34、CD45。②反转录病毒感染骨髓间充质干细胞的感染效率约为10％，修饰后形成的脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞在形态上始终保持一致，与骨髓间充质干细胞几乎完全一样，生长速率与未经基因修饰的骨髓间充质干细胞基本相同，培养10代后细胞停止分裂，免疫细胞化学染色显示脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞的脑源性神经营养因子阳性率超过98％，培养72h后培养基中脑源性神经营养因子的含量较之骨髓间充质干细胞提高约20000倍。③PCR对脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞基因组DNA进行扩增，得到外源性脑源性神经营养因子条带。结论：利用反转录病毒载体进行基因修饰得到了稳定的脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞有限细胞系，为基因治疗提供了一种以多潜能成体干细胞为载体的种子细胞。     

肌损伤浸液对骨髓间充质干细胞增殖及其成肌诱导作用

背景骨髓问充质干细胞具有可诱导分化为成骨细胞及成软骨细胞,利用DNA甲基化抑制剂5一氮杂胞昔可诱导问充质干细胞表达生肌调控因子中的myf5及生肌素,可以使间充质干细胞定向分化为成肌细胞.目的通过筛选蛋白含量最高时相的肌损伤浸液作用于骨髓问充质干细胞,探讨肌损伤浸液对问充质于细胞增殖及成肌诱导作用.设计标准对照实验.单位解放军第三军医大学预防医学院复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室.材料 Balb/C纯系小鼠18只造成肌肉组织的创伤模型,用于肌损伤浸液的提取,同时以5一氮杂胞昔诱导的问充质干细胞成肌组进行对照.方法实验于2001一04/2003 09在第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤及复合伤国家重点实验室进行.Bradford比色法检测不同时相肌浸液蛋白含量,筛选蛋白含量最高时相的肌损伤浸液作用于骨髓间充质干细胞,于0,3,6,9,12,15 d采用四甲基偶氮哩盐法检测伤浸液对问充质于细胞增殖的影响,与未加浸液的问充质干细胞作对照.采用反转录聚合酶链反应法检测其作用后66生肌素的表达,并与用5一氮杂胞音诱导的间充质干细胞成肌分化进行对照.主要观察指标Balb/c小鼠①肌损伤浸液蛋白含量测定.②肌损伤浸液对问充质干细胞增殖的影响.③以生肌素的表达观察肌损伤浸液对问充质干细胞的成肌诱导作用.结果①肌损伤浸液蛋白含量分析以损伤后12 h为最高.②肌损伤浸液对间充质干细胞增殖的影响伤浸液作用组间充质干细胞的增殖活力在各时相均明显高于对照组.③肌损伤浸液对间充质干细胞的成肌诱导作用伤浸液作用组无生肌素的表达,5一氮杂胞耷作用组有较强的生肌素表达.结论肌损伤浸液可促进间充质于细胞的增殖,但对问充质干细胞无成肌诱导分化作用.     

超声对肝纤维化和肝硬化半定量诊断探讨--肝被膜形态及肝内韧带观察

目的 探讨高频超声及超声附加方法观察肝表面被膜形态的异常程度及半定量化分级对肝纤维化、肝硬化的诊断价值。方法 经手术及病理证实的肝硬化患者127例为病变组，以因其他肿瘤行手术治疗而临床无阳性发现并经手术肉眼观察判断非肝硬化患者56例为对照组，采用高频探头、二次谐波成像、局部放大图像、调节聚焦和适当降低增益等5种超声附加方法观察肝被膜形态及厚度等。评价标准分为5个等级：肝被膜细而平整为0级；肝被膜轻度增厚、回声增强为I级；肝被膜增厚、呈细水纹状欠平整为Ⅱ级；肝被膜明显增厚、呈小结节状或节段状不连续为Ⅲ级；肝被膜明显增厚，呈波浪状凹凸不平为Ⅳ级。对本组病例肝圆韧带结构形态的观察：细而平整、厚度≤2mm为正常；增厚、不平整、回声增强等为异常表现。结果 病变组127例中，肝被膜显示0级11例，Ⅰ级21例，Ⅱ级27例，Ⅲ级32例，Ⅳ级36例。对照组56例中显示O级48例，Ⅰ～Ⅱ级8例。依据此分级评价标准检测肝被膜形态异常程度，敏感性91．3％，特异性85．7％，正确率89．6％。病变组肝内韧带异常者，肝纤维化占75．0％(9／12例)，肝硬化占95．5％(64／67例)；而正常组仅4例(8．9％)异常。结论对肝被膜结构细微变化的分级，可较灵敏反映肝纤维化和肝硬化病理学异常改变，对提高肝纤维化及早期肝硬化的诊断有参考价值，为肝弥漫性病变进展程度的判断提供半定量化诊断依据。     

慢性局灶性胰腺炎的超声诊断

目的 超声分析研究慢性胆囊炎、胆结石患者中，进行腹腔镜胆囊摘除术后仍有手术前临床症状的个体，明确其病因。方法 对31例慢性胆囊炎、胆结石手术后仍有腹痛、背痛、呕吐、间歇性腹泻的患者和30例无胆道系统及其他消化系统疾病的个体(随机抽样)进行胰腺形态学、声学和实验检测(血、尿中胰淀粉酶含量及粪便中有无脂肪颗粒)，并对比分析。结果 慢性胆囊炎、胆结石手术后仍有腹部症状患者超声显示胰头部增大、回声增强、不均匀；血清胰淀粉酶增高7例(占22．6％)，尿中淀粉酶增高11例(占35．5％)，粪便中有脂肪颗粒28例(占90．3％)，血糖轻度增高18例(占58．1％)。对照组30例实验室检测均正常。超声显示胰腺均正常。结论 局灶性胰腺炎在超声形态学及声学改变上有其独特的表现，与实验室辅助检测相结合可以大大提高诊断准确率。