骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 获取成年大鼠胫骨干骨髓，采用贴壁法进行间充质干细胞的培养、传代，观察经5-氮胞苷诱导后骨髓间充质干细胞的生长和分化。结果 大鼠骨髓基质细胞贴壁旱集落生长，5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，结论 骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，为自体心肌细胞移植提供了一种良好的来源。     

大鼠肌卫星细胞成肌分化的体外实验研究

目的探讨肌卫星细胞体外分化和烟碱型乙酰胆碱受体表达。方法采用胰蛋白酶消化SD乳鼠的骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法纯化,进行体外培养,观察卫星细胞的分化过程,利用免疫组织化学方法进行鉴定。用银环蛇毒素鉴定细胞表面的烟碱型乙酰胆碱受体,并用乙酰胆碱刺激细胞观察其收缩功能。结果体外培养的肌卫星细胞分化为成肌细胞,融合成肌管。α-sarcomeric actin.skeletal myosin 和 desmin t抗体鉴定为阳性。ACh可刺激卫星细胞形成的肌管收缩。卫星细胞无明显的N—ACh受体表达;而卫星细胞形成的肌管经分化培养后N—ACh受体呈局部块状聚集。结论肌卫星细胞分化后形成的肌管具有收缩功能,并且在分化过程中逐渐合成烟碱型乙酰胆硅罟仕     

人胎盘间充质干细胞在不同改性处理聚苯乙烯表面的生长效应

背景：人胎盘间充质干细胞(Placenta mesenchymal stem cells, PMSCs)是细胞治疗、再生医学以及免疫调节治疗的重要种子细胞,其培养表面的研究是关系优化PMSCs培养体系的重要课题。 目的：观察磺化法、次大气压等离子技术和多聚赖氨酸包被技术改性的聚苯乙烯培养表面对人PMSCs体外培养的影响。 设计、时间及地点：体外对比观察实验,于2007-03/2008-10在北京纵横洋洲医药生物技术公司生物塑料实验室完成。 材料：聚苯乙烯3.5 cm2培养皿和24孔培养板由北京纵横洋洲医药生物技术有限公司提供,多聚赖氨酸购自美国Sigma公司。人正常分娩期胎盘由北京人民医院提供,并经产妇知情同意。 方法：以磺化法、次大气压等离子技术、多聚赖氨酸包被技术改性聚苯乙烯培养表面,将体外分离的人胎盘小叶中有核细胞分别接种到不同改性处理的培养表面,贴壁法获得PMSCs克隆,传代培养。 主要观察指标：观察不同改性处理的聚苯乙烯培养表面的表面张力;PMSCs在不同培养表面培养的原代培养克隆率、接种培养贴壁率;测定细胞生长曲线。 结果：聚苯乙烯培养表面采用不同方法改性后,其表面张力：等离子组>多聚赖氨酸组>磺化组>对照组;培养表面表面张力越大,人PMSCs原代培养克隆率和继代培养贴壁率越大,而多聚赖氨酸包被的培养表面更有利于原代分离人PMSCs;培养表面表面张力的增加能有效缩短人PMSCs接种后恢复期。 结论：鉴于多聚赖氨酸改性大幅增加了培养成本并有污染细胞的可能,建议采用多聚赖氨酸改性表面实施PMSCs原代培养,等离子改性表面实施PMSCs继代培养。     

大鼠肌源性干细胞的分离、纯化和培养☆

背景：要获得满足临床需要的肌源性干细胞,体外筛选和扩增已成为关键环节。 目的：拟建立稳定高效的成年大鼠肌源性干细胞的分离培养、纯化方法。 方法：成年SD大鼠麻醉后,无菌条件下取骨骼肌,采用XI型胶原酶、Dispase和胰酶消化法获得肌源性干细胞,以密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化。记录细胞生长曲线,MTT比色法观察不同接种密度对细胞生长的影响,采用免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。 结果与结论：原代肌源性干细胞体积较小,贴壁缓慢,折光性较好,多呈球形、梭形或纺锤形,增殖缓慢。传代培养后,加入含体积分数为20%血清浓度的完全培养基,以1×109 L-1密度接种时活细胞数量最多,为适宜接种密度,传1~4代细胞生长状态良好。免疫细胞化学染色结果为desmin(+),CD34(+),CD45(-),Sca-1(+),证实通过体外原代培养获得了高纯度的肌源性干细胞,并成功扩增。     

两种不同基质的联合应用对体外分散培养神经元的促贴壁作用

随着神经生物学的飞速进展,神经细胞原代培养成为神经药理、病理生理及活性物质等方面研究的一个很好模型。为此,观察和分析神经元体外特性神经元存活、突起生长以及神经元形态变化等的一些指标也相继出现。由于分散的单一细胞培养能够比较理想地反映在体情况,现多选用这一方法进行体外调控和观察。但是培养中细胞脱落和细胞重聚现象又给结果分析造成一定困难,影响了实验结果的客观性。因此,需选择合适的细胞外基质来解决这些问题。常用的细胞外基质有胶原和多聚赖氨酸。胶原ＩＶｃｏｌｌａｇｅｎＩＶ是一种细胞支持物,它是细…     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓问充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,I型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,I型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

骨髓间充质干细胞的成骨性诱导

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的效果。方法:采用全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,把生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为两组,对照组用DMEM-LG培养基培养;实验组用含有成骨诱导剂的DMEM-LG培养基培养。结果:全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁且呈梭形;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组(P<0.01),茜素红染色出现阳性的钙化结节。结论:全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。