GDF-5基因重组腺病毒修复人退变髓核细胞的实验研究

【摘要】 目的 探讨腺病毒介导的GDF 5基因对人退变髓核细胞外基质表达的影响,探求一种基因治疗新途径。方法 利用腺病毒载体将GDF 5基因导入退变髓核细胞,设置为空白对照组（Control组）、阴性对照组（GFP组）、实验组（GDF 5组）3组,并分为3、7、14、21天四个观察时间点,分别检测3组髓核细胞sGAG、Hyp的含量,免疫染色、Safranine O染色观察细胞外基质合成情况,Real time PCR检测Aggrecan、Collagen II mRNA表达水平。结果 GDF 5组髓核细胞sGAG/DNA、Hyp/DNA均在14、21天较Control组和GFP组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）,而Control组与GFP组之间任意观察时间点比较差异均无统计学意义（P＞0.05）;免疫染色、Safranine O染色结果显示GDF 5组髓核细胞的蛋白多糖、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖在14、21天均呈强阳性染色,Control组和GFP组呈弱阳性染色。Real time PCR结果显示GDF 5组Aggrecan、Collagen II mRNA的表达在14、21天较Control组和GFP组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 腺病毒介导的GDF 5能明显促进人退变髓核细胞Aggrecan、Collagen II mRNA的表达,并增加蛋白多糖、Ⅱ型胶原的合成,对细胞外基质具有明确的修复作用,是一种有效的基因治疗新方法。     

EMA-PCR技术快速鉴别死活腺病毒的初探

目的 探讨采用叠氮溴化乙锭（EMA）联合聚合酶链反应（PCR）快速鉴别死活腺病毒的方法。方法将不同稀释度的病毒接种至生长良好的单层细胞上,通过细胞病变效应（CPE）的发生情况计算病毒滴度;将3种腺病毒和新城疫鸡瘟病毒分别制备成106 PFU/mL的母液并梯度稀释备用,提取DNA后用PCR扩增后进行凝胶电泳,观察目的片段的扩增结果;分别用0 μg/mL、70 μg/mL、120 μg/mL和150 μg/mL的EMA处理灭活后的腺病毒,提取DNA进行PCR,观察目的片段的电泳结果;用120 μg/mL的EMA处理107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL、104 PFU/mL、103 PFU/mL的腺病毒,观察PCR和凝胶电泳结果。结果 104 PFU/mL及以上滴度的病毒DNA PCR后得到阳性条带,其他滴度的病毒DNA PCR后未检测到阳性条带;3个型别的腺病毒（共8个分离株）的DNA均扩增出目的条带,新城疫鸡瘟病毒的DNA未扩增出目的条带;120 μg/mL及150 μg/mL的EMA抑制灭活腺病毒DNA 扩增,未得到阳性条带;120 μg/mL EMA不影响107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL的腺病毒活病毒DNA扩增,得到阳性条带。结论 本研究证实EMA-PCR方法可快速鉴别死活腺病毒,能有效避免单纯PCR检测腺病毒产生的假阳性结果。     

丝氨酸羟甲基转移酶2在小鼠肝再生过程中的变化规律及作用

目的 探索丝氨酸羟甲基转移酶2(serine hydroxymethyl transferase 2,SHMT2)在小鼠肝再生过程中的表达规律,以及其对小鼠肝再生是否有促进作用.方法 SPF级C57BL/6小鼠120只分为肝切除组(2/3 PH)、假手术组(SHAM)、腺病毒干扰组(siSHMT2)及注射生理盐水对照组(Control),每组30只;肝切除组下设1、3、5、7、9d5个时相点,每个时相点6只.小鼠肝切除之后分别取1、3、5、7、9d的肝脏组织及血清,采用qPCR、Western blot和免疫组化检测SHMT2及其下游分子甘氨酸脱氢酶(glycine dehydrogenase,GLDC)的变化规律、血清中丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)的浓度.取注射腺病毒干扰SHMT2第5天的肝脏组织,通过Westernblot和观察荧光强度,确定转染效果,并检测血浆中ALT和AST水平,免疫组化检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA).结果 SHMT2及其下游分子GLDC在小鼠肝再生的后第5、7天表达最高,qPCR检测结果显示,SHMT2第5天的表达量是第1天的1.63倍(P＜0.05).在干扰SHMT2之后,小鼠第5天再生肝脏的质量由(0.79±0.13)g降低至(0.63 ±0.ll)g(P ＜0.05),再生度由(36.37±2.21)％降低至(31.33±1.92)％,肝指数由(3.76±0.44)％降低至(3.13±0.29)％,并且肝功能指标ALT由(70.00±9.52) U/L升高至(154.15±16.49) U/L,AST由(140.09±32.85) U/L升高至(403.41±68.63) U/L(P＜0.05),PCNA阳性率从(53.6±2.3)％降低至(39.0±3.2)％(P＜0.05).结论 SHMT2在肝脏再生的后期高表达,促进残肝的再生,其机制可能与增强肝脏对缺血、缺氧的耐受,提高三磷酸腺苷水平有关.     

AAV-TGFβ1的构建及其与AV-TGFβ1对髓核细胞蛋白多糖合成影响的比较

目的探讨转化生长因子β1腺相关病毒表达系统(AAV-TGFβ1)的构建及其与转化生长因子β1腺病毒表达系统(AV-TGFβ1)对髓核细胞蛋白多糖合成影响的比较。方法采用PCR技术扩增转化生长因子β1(TGFβ1)基因,并于其两端分别连接EcoRI和SalI酶切位点。将TGFβ1基因亚克隆于腺相关病毒(AAV)载体中,并经酶切和测序分析进行鉴定。AAV-TGFβ1病毒被包装并转染H293细胞,通过免疫荧光检测AAV介导的目的基因表达。利用AAV-EGFP病毒检测AAV对髓核细胞的转染效率。AAV-TGFβ1和AV-TGFβ1分别转染髓核细胞后,通过Antonopulos法检测蛋白多糖的合成。结果测序分析证明TGFβ1序列与NCBI Gene Bank所报道的一致。经酶切鉴定证实AAV-TGFβ1重组质粒被成功构建。AAV可介导TGFβ1高效表达并高效转染髓核细胞。AV-TGFβ1可快速一过性地促进髓核细胞蛋白多糖合成,而AAV-TGFβ1可稳定促进蛋白多糖合成。结论AAV-TGFβ1病毒被成功构建并可稳定地促进髓核细胞蛋白多糖的合成。     

人肾间质纤维母细胞培养及血管紧张素Ⅱ2型受体转染表达

目的：体外培养人肾间质纤维母细胞（hRIF)并用腺病毒介导转染表达血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）。方法：用肾穿刺活检法取慢性肾小球肾炎病人肾组织,以常规组织块贴壁法培养hRIF;构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),体外转染hRIF;用RT-PCR方法检测AT2RmRNA表达,免疫组织化学法及蛋白免疫印迹法检测AT2R蛋白表达,流式细胞仪检测AT2R表达0率,同时检测AT1R的表达变化。结果：用肾活检组织成功培养出hRIF,构建的AdCMV-AT2R体外转染培养hRIF表达率为90.57%,以免疫组化、免疫印迹和RT-PCR检测AT2R表明,转染后AT2R表达明显增强。并随表达时间延长而增加,48h为表达峰值。AT2R转染表达不影响AT1R表达,结论：腺病毒载体可较高效率介导AT2R在hRIF的转染表达,ATIR表达不受其影响。转染表达AT2R的hRIF可作为研究AngⅡ在肾间质纤维化中作用的良好细胞模型。     

腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统杀伤膀胱癌细胞的研究

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／更昔洛韦（HSV－tk/GCV)系统杀伤膀胱癌细胞的作用。方法;采用人巨细胞病毒早期蛋白启动子驱动HSV－tk基因重组腺病毒（Ad)载体,体外转染HTB9和Scan BER细胞,MTT法测定杀伤率,PCR检测Ad-tk转染细胞中tk基因及腺病毒E1区基因。结果：GCV对转染的癌细胞有杀伤作用,感染复数（MOI）100时,10mg/L GCV杀伤80％的tk^ 细胞,而对未转染的细胞无杀伤作用。不同MOI的Ad-tk转染两种细胞,其毒性与Ad-tk MOI正相关,MOI100时,15mg/L GCV杀伤100％的细胞,无GCV组未受到抑制。PCR证实Ad-tk转染细胞有tk基因,腺病毒E1区基因阴性。Annexin V法证实杀伤效应与凋亡有关。结论：HSV-tk/GCV系统是一种有效,安全治疗膀胱癌的新方法。     

腺病毒介导的双自杀基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 探讨直肠癌的基因治疗方法。方法 用重组腺病毒介导外源胞嘧啶脱氨酶（CD）基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk）基因转移到人直肠癌细胞系HR－8348,通过细胞集落形成实验、细胞存活率测定（MTT法）,检测、分析CD和HSV－tk双自杀基因系统对肿瘤细胞的作用。结果 重组腺病毒介导的CD和HSV－tk自杀基因可在HR－8348细胞高效表达。用腺病毒穿梭质粒pAdCMV-Linkl(CD tk)、Linkl(-)、pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Kinkl(tk）重组腺病毒感染HR－8348细胞,不加5－氟胞嘧啶（5－FC）、环氧鸟苷（GCV）,各组肿瘤细胞的集落形成和存活率的差异无显著性意义（P＞0．05）。应用5－FC、GCV后,pAdCMV-Linkl(CD tk)转染组细胞集落形成和存活率显著低于对照组pAdCMV-Link（－）转染组（P＜0．01）,也低于pAdCMV-Linkl(CD)、pAdCMV-Linkl(tk）转染组（P＜0．05）。CD和5－FC、HSV－tk和GCV系统联合使用较单一自杀基因系统对HR－8348直肠癌细胞的集落形成、细胞生长有更显著的抑制作用,对肿瘤细胞有更强的杀伤能力和“旁观者效应”。结论 CD和HSV－tk双自杀基因联合作为肿瘤基因治疗的一种手段和方法,较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。     

应用细菌重组系统构建小鼠Flt3配体的重组腺病毒及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建携带小鼠Flt3配体（murine flt3 ligand,mFL)的重组腺病毒载体并检测它的感染后的小鼠肝癌细胞中的表达。为肝癌基因治疗提供实验基础。方法 PCR扩增含有mFL的质粒,应用高效细菌内同源重组系统构建携带mFL的重组腺病毒,感染小鼠肝癌细胞株Hepal-6,一步法提取细胞总RNA,RT-PCR检测mFL的表达。结果 构建了携带mFL的重组腺病毒,并在感染后的Hepal-6细胞中检测到了mFL的mRNA。结论 应用该细菌重组系统成功地构建了携带mFL的重组腺病毒载体。为下一步的基因治疗研究奠定了基础。     

RNAi人端粒酶逆转录酶基因腺病毒表达载体的构建及对肾癌细胞生长的抑制作用

目的 构建表达端粒酶逆转录酶(hTERT)基因小干扰RNA(siRNA)腺病毒载体,观察其对肾癌细胞系Ketr-3生长抑制作用.方法 将病毒Ad-hTERT体外感染人肾癌细胞系Ketr-3,分别用结晶紫染色、噻唑蓝(MTT)法检测其对细胞生长的影响,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定hTERT基因mRNA的表达水平,免疫组织化学检测hTERT抗原的表达.结果 结晶紫、MTT结果表明:在MOI=50时,Ad-hTERT感染的Ketr-3细胞发生明显病变;MOI=50的Ad-hTERT感染Ketr-3细胞后,在第3、5、7天细胞存活率分别为(92.3±1.2)%、(82.0±1.0)%和(72.0±1.0)%,与对照组比较差异有统计学意义(P《0.05);RT-PCR结果表明:病毒Ad-hTERT感染Ketr-3细胞3d后,hTERT mRNA表达是对照组的(50.5±1.7)%,差异有统计学意义(P《0.01);免疫组织化学结果表明:Ad-hTERT处理组的hTERT抗原表达较对照组显著减少.结论 转录hTERT基因siR-NA的重组腺病毒载体为肾癌基因治疗提供了新的工具.     

腺病毒载体介导的CTLA4Ig基因追踪臂丛神经通路的研究

目的 利用腺病毒载体(Ad)介导的CTLA4Ig基因示踪大鼠臂丛神经轴突及其运动和感觉神经元,探讨转基因产物CTLA4Ig蛋白作为神经通路示踪剂的可行性及其特点.方法 经正中神经或尺神经或肌皮神经近断端导入携带CTLA4Ig或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的Ad(各2×107pfu).在转染后3周内6个不同时间点取标本,行CTLA41g免疫荧光染色,观察标记的运动及感觉神经元所在脊髓和脊髓后根神经节(DRGs)节段、神经根及轴突被标记范围及时间,并与EGFP基因的示踪结果比较.结果 由正中神经、尺神经和肌皮神经所标记的神经元分别在C6～Th1、c7～Th1及C5～C7节段;其相应的神经根及神经干近段轴突亦被标记.CTLA4Ig标记的神经元在转染3周后消失,所标记神经干轴突在转染5周后消失;而EGFP所标记的神经元和神经干分别2周、3周后消失.结论 CTLA4Ig基因能在Ad介导下经外周逆行性、特异性示踪臂丛神经及其靶运动和感觉神经元.