体外导入外源IL-10基因对HSC增殖的影响

目的利用重组复制缺陷型腺病毒AdIL 10将外源IL 10基因导入肝星状细胞 (HSC) ,并观察其对HSC增殖的影响。方法将本实验室自行构建的重组腺病毒质粒pAdIL 10用Lipofectamin包装转染HEK 2 93细胞 ,即可获得重组腺病毒AdIL 10。应用胶原酶原位灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC ,当HSC生长至 80 %密度时 ,以 5× 10 4细胞 /孔接种于 96孔板 ;HSC培养 2 4h后 ,取病毒AdIL 10以感染复数 (MOI) 5 0感染HSC ;用MTT法检测HSC增殖率。结果pAdIL 10经 2 93细胞包装 ,3d后可观察到绿色荧光蛋白 (GFP)表达 ;AdIL 10感染HSC 3d后可观察到GFP表达 ,且HSC增殖受到抑制。结论重组腺病毒AdIL 10感染HSC后可抑制其增殖     

腺病毒介导AMP激活的蛋白激酶的过表达诱导肝星状细胞株LX2凋亡

目的 探讨在肝星状细胞株LX2中,用腺病毒介导AMP激活的蛋白激酶(AMPK)过表达对细胞凋亡的影响.方法 病毒感染细胞后,用免疫印记的方法检测外源基因的表达;流式细胞仪分析细胞的凋亡;琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状条带,免疫印迹检测caspase-3以及Bcl-2、Bax表达的变化.结果 免疫印迹结果显示表达组成性激活的AMPK的腺病毒感染LX2细胞72 h,AMPK过表达.过表达AMPK的LX2细胞用流式细胞仪检测到有凋亡的亚二倍体峰出现;DNA断裂出现梯状条带,casepase-3被激活,Bcl-2在LX2中是低表达的,而Bax表达水平升高.结论 腺病毒介导AMPK的过表达可以诱导LX2细胞发生凋亡,其可能的机制之一是上调促凋亡基因bax的表达.     

人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测.方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体.PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒.体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达.结果成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL.体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达.结论构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎治疗奠定实验基础.     

人S100 A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。     

重组嵌合腺病毒35型和重组痘苗病毒SIV疫苗在小鼠体内联合免疫的实验研究

目的:研究嵌合腺病毒35型载体和痘苗病毒载体SIVenvT疫苗通过不同策略联合免疫小鼠所诱导的细胞和体液免疫应答。方法:通过PCR和Western blot方法对表达SIV mac239株SIVenvT基因的重组嵌合腺病毒35型(rAd5F35-SIVenvT)和重组痘苗病毒安卡拉株(rMVA-SIVenvT)进行体外...     

成人腺病毒肺炎8例临床分析

目的：总结8例成人腺病毒肺炎患者的临床资料,为腺病毒肺炎的早期诊治提供依据。方法：回顾性分析2019年1月至2021年12月山东省东营市人民医院诊治的8例成人腺病毒肺炎住院患者的病例资料。结果：8例患者中,中青年男性占多数。主要临床表现为发热、咳嗽、咳痰、畏寒、咽痛、寒战、乏力、肌痛、腹泻和关节酸痛。实验室检查以白细胞正常、单核细胞计数升高、C反应蛋白升高、肌酶升高、乳酸脱氢酶升高为主。典型的影像学表现以单侧或双侧肺分布的斑片影及周围有磨玻璃影的团片样实变影为主。经利巴韦林抗病毒及对症治疗,8例均好转出院。结论：在初春或冬季,高热、咳嗽、肺部实变影或实变周围伴磨玻璃影的肺炎患者,需警惕腺病毒肺炎的发生,以期及早诊治。     

昆明市幼儿病毒性腹泻病原学监测分析

目的 了解云南省昆明市病毒性腹泻的病原谱特征,探索其流行规律,以期为病毒性腹泻患儿临床治疗及制定有针对性的防控措施提供参考.方法 采集2018年1月至2019年12月因腹泻就诊的昆明市5岁以下患儿粪便标本,用实时荧光定量PCR方法进行核酸检测,检测轮状病毒、诺如病毒、腺病毒、星状病毒及札如病毒,并分析各种病毒的流行病学...     

细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体及体外表达

目的: 构建表达人类晶状体来源的上皮生长因子 p52(LEDGFp52)重组腺病毒载体,检测 LEDGFp52 重组腺病毒能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法: 将 LEDGFp52 基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack- CMV上构建腺病毒穿梭载体 pAdTrack- CMV-LEDGFp52,将腺病毒穿梭载体 pAdTrack- CMV- LEDGFp52 与5 型腺病毒骨架质粒 pAdeasy- 1 共转染 BJ5183 细菌, 经细菌内同源重组产生携带 LEDGFp52 基因的重组腺病毒载体 pAd- LEDGFp52, 将 pAd- LEDGFp52 经脂质体法转化293 细胞包装产生重组腺病毒 Ad- LEDGFp52, 将 Ad-LEDGFp52 体外转染 293 细胞, CPE 法及 westernblot 观察目的基因的表达。结果: 构建了表达 LEDGFp52 基因的重组腺病毒质粒, E.coli 内成功同源重组腺病毒, 在 293 细胞内包装产生重组腺病毒 Ad- LEDGFp52, 滴度可达 5×1012 pfu/L。在真核细胞中有效表达目的基因 LEDGFp52, 出现显著的 CPE 效应。结论: 成功构建表达 LEDGFp52 的重组腺病毒载体, 为进一步进行 LEDGF p52 基因功能的研究提供了实验基础。     

儿童呼吸道感染人腺病毒核酸检测结合多指标分析

目的:了解厦门儿童人腺病毒(Human Adenovirus,HAdv)感染流行病学、临床特征.方法:回顾性分析2019年7月～2020年6月呼吸道感染儿科住院病例1793例,分析不同年龄段、性别、季节人腺病毒感染与临床特征差异.结果:HAdv-DNA阳性率为18.74％(336/1793),其中男、女性阳性率分别为1...