亚细胞蛋白质组学技术分析MG132诱导HL-60细胞G2/M期阻滞的分子机制

背景与目的：蛋白酶体抑制剂能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,是一种有应用前景的抗肿瘤制剂。本研究通过对蛋白酶体抑制剂——MG132诱导G2／M期阻滞的HL-60细胞核蛋白进行蛋白质组学分析,探索参与HL-60细胞G2／M期阻滞调控的相关蛋白。方法：流式细胞术分析MG132处理的HL-60细胞周期,选取合适的时间点,提取细胞核,光镜和Western blot检测细胞核纯度,裂解制样,通过二维电泳和MALDI-TOF-TOF串联质谱分析,鉴定表达显著差异的细胞核蛋白。结果：HL-60细胞在被2．5μmol／L MG132诱导凋亡之前8h,有明显的G2／M期阻滞发生：提取阻滞发生时和阻滞发生前的HL-60细胞核蛋白,二维电泳分析获得23个差异表达的蛋白点,质谱鉴定了8个核蛋白。结论：质谱鉴定的eIF5A、mRNA前体剪接因子等蛋白可能参与HL-60细胞的GJM周期阻滞调控。为研究蛋白酶体抑制剂诱导白血病细胞周期阻滞及凋亡的分子机制提供了一些线索。     

α-Syn过表达对帕金森病模型小鼠黑质多巴胺受体D1表达的影响

目的 探讨α-突触核蛋白(α-Syn)过表达对帕金森病(PD)小鼠黑质多巴胺受体D1(D1DR)表达的影响.方法 选取雄性C57BL/6J小鼠16只,随机将小鼠分为PD组和对照组,每组各8只.采用脑纹状体注射α-Syn预成型纤维(α-Syn PFF)法建立PD模型,对照组以相同方法注射PBS.各组小鼠于造模前1周及造模...     

α-突触核蛋白对内质网应激及细胞凋亡影响

目的:构建α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)和SNCA突变基因(SNCAmu)过表达转染293T细胞,观察内质网应激及细胞凋亡.方法:应用PCR技术扩增目的基因并插入慢病毒载体质粒,重组质粒的构建及包装293T细胞,转染24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescent prot...     

水木和宁方对帕金森病模型小鼠泛素-蛋白酶体系统的影响

目的:基于泛素-蛋白酶体系统(UPS)研究水木和宁方对帕金森病(PD)小鼠的影响。方法:C57BL/6小鼠颈背部皮下注射鱼藤酮建立慢性PD小鼠模型。造模成功PD小鼠随机分为模型对照组、美多芭0. 15 g/kg组、水木和宁方15、30、60 g/kg组。治疗组每天灌胃给药2次,溶剂对照组和模型组给予等体积生理盐水,连续4 w。观察小鼠行为学改变;免疫组化检测中脑黑质α-突触核蛋白(α-syn)、酪氨酸羟化酶(TH)表达; WB和RT-PCR方法检测中脑黑质α-syn、TH及UPS相关的蛋白及mRNA表达。结果:与溶剂对照组比较,PD模型对照组小鼠前肢、后肢步长显著降低,游泳评分显著降低,中脑黑质TH阳性细胞数显著降低,α-syn阳性表达显著上调,α-syn蛋白及mRNA表达明显上调,TH、u BE1、Parkin、UCH-L1、Ubiquitin蛋白及mRNA表达明显下调(P <0. 05或P <0. 01)。与模型对照组比较,水木和宁方15 g/kg、30 g/kg、60 g/kg组小鼠行为学改变明显改善;中脑黑质TH阳性细胞数显著增加,α-syn阳性表达显著下调; TH、UPS相关蛋白及mRNA表达明显上调,α-syn蛋白及mRNA表达显著下调(P <0. 05或P <0. 01)。结论:水木和宁方可能通过调节UPS功能,促进α-syn的降解,从而改善PD小鼠的运动功能。     

α-突触核蛋白在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位

目的研究α-突触核蛋白（α-synuclein）在正常大鼠脑神经元中的亚细胞定位,为阐明其正常的生理功能提供线索.方法超小金标记结合银增强免疫电镜技术.结果α-突触核蛋白不仅存在于神经细胞的突触前终末,也见于神经细胞的轴突、胞浆与核中.在突触前终末,α-突触核蛋白的分布与突触小泡无明显的关系.在神经细胞核内,靠近核膜部分α-突触核蛋白的分布较为密集,细胞核中心部位α-突触核蛋白则较为稀疏.在胞浆和轴突中,α-突触核蛋白散在分布.另外,在线粒体中也有该蛋白表达.结论α-突触核蛋白广泛分布于神经元的各个部位,可能参与神经元的多种生理功能.     

α-突触核蛋白聚集及传播模型的构建

目的 建立α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集及传播的细胞和动物模型,为帕金森病的发病机制研究提供基础。方法 亲和层析法纯化α-syn蛋白,体外诱导其聚集成为α-syn纤维(Preformed fibrils,PFFs); 培养稳定表达GFP-α-syn的HEK293细胞系及原代神经元,转导α-synPFFs后免疫荧光染色法观察细胞内α-syn聚集情况; 小鼠立体定位注射α-syn PFFs,免疫组织化学法检测内源性α-syn的聚集及传播情况。结果 纯化的α-syn可在体外聚集形成聚集体; 在细胞及动物水平观察到α-syn PFFs可诱导内源性蛋白的聚集和传播。结论 本研究建立了α-syn聚集及传播的细胞和动物模型,为帕金森病的相关研究打下了基础。     

枸杞多糖对颅内动脉瘤大鼠NF-κB信号通路及血管内皮组织炎性损伤的影响

目的 探讨枸杞多糖(LBP)对颅内动脉瘤(IA)大鼠核蛋白因子-κB(NF-κB)蛋白通路及血管内皮组织炎性损伤的影响。方法 取SD雌性大鼠50只,采用切除双侧卵巢并结扎左侧颈总动脉及双侧肾动脉后支以构建IA模型,随机分为IA模型组、LBP低(5 mg/kg)、中(10 mg/kg)、高(20 mg/kg)剂量组,另取10只大鼠,只暴露卵巢、颈总动脉、双侧肾动脉后支,不进行摘除和结扎,作为对照组(Control组); 各组均于手术1周后,开始给药,Control组、IA模型组经灌胃给予生理盐水,LBP各剂量组灌胃给予相应剂量药物,1次/d,共给药30 d; 末次给药12 h后处死,取大鼠血液用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清炎性因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及血管内皮损伤标志物血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮素(ET)水平; 分离取出大鼠脑动脉(Wills)环,在40倍显微镜下检查大脑动脉(Wills)环病理改变,并检测动脉瘤血管壁厚度及动脉瘤体积; 取脑动脉瘤血管组织,用苏木精-伊红染色(HE)检测动脉瘤血管组织病理变化; 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测动脉瘤血管组织NF-κB,Toll样受体-4(TLR4)蛋白表达水平。结果 与Control组比较,IA模型组大鼠Willis环上凸起、管壁厚度和肿动脉瘤体积、动脉瘤内皮细胞空泡变性及炎性细胞浸润等病理损伤程度、血清IL-6,TNF-α,VEGF,ET水平、动脉瘤血管组织NF-κB和TLR4蛋白表达水平明显升高(P<0.05); 与IA模型组比较,LBP低、中、高剂量组大鼠Willis环上凸起、管壁厚度和动脉瘤体积、动脉瘤内皮细胞空泡变性及炎性细胞浸润等病理损伤程度、血清IL-6,TNF-α,VEGF,ET水平、动脉瘤血管组织NF-κB和TLR4蛋白表达水平明显降低(P<0.05),且LBP各剂量组上述指标水平呈剂量依赖性降低。结论 LBP可能通过抑制TLR4/NF-κB通路激活、降低炎症反应来减轻IA血管内皮组织损伤。     

α-Synuclein磷酸化修饰提高MN9D细胞内TH的活性

目的观察突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)第129位丝氨酸(Ser129)磷酸化修饰对酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)活性的影响。方法应用重叠延伸PCR定点突变法将129位丝氨酸编码碱基TCT突变为天冬氨酸(Asp,D)编码碱基GAT,获得编码模拟磷酸化α-Syn(S129D α-SYN)的DNA序列,插入逆转录病毒真核表达载体(pLNCX2)。包装逆转录病毒颗粒并感染多巴胺能神经细胞MN9D。通过实时定量RT-PCR鉴定α-SYN基因表达,Western blot检测TH磷酸化水平。结果pLNCX2-α-SYN(wild type/S129D)质粒测序结果正确,并在MN9D细胞中均过表达。野生型α-SYN过表达组同正常对照组相比TH磷酸化水平降低(P<0.01),而S129D α-SYN组TH的磷酸化水平同正常对照组相比明显升高(P<0.05)。结论在MN9D细胞中,野生型α-SYN抑制TH的活性,而α-SYN Ser129磷酸化后TH活性明显升高。     

癫痫患儿血清α-突触核蛋白和热休克蛋白70的表达及临床意义

目的探讨癫痫患儿血清α-突触核蛋白(α-Syn)、热休克蛋白70(HSP70)的变化,分析二者与认知功能、事件相关电位、血清炎症细胞因子的关系。方法选取该院2016年8月至2019年8月收治的癫痫患儿105例作为癫痫组,根据癫痫类型进一步分为癫痫1组(癫痫频发)、癫痫2组(癫痫持续状态)、癫痫3组(非频发非持续状态)。另选取同期体检的健康儿童68例为健康对照组。检测并比较各组血清α-Syn、HSP70、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。观察各组中国韦氏儿童智力量表(C-WISC)评分及事件相关电位P300。分析血清α-Syn、HSP70水平与认知功能、事件相关电位P300潜伏期、炎症因子的相关性。结果癫痫组血清α-Syn、HSP70、IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平高于健康对照组,P300潜伏期较健康对照组延长,而C-WISC评分低于健康对照组,差异有统计学意义(P0.05)。癫痫1组、癫痫2组的血清α-Syn、HSP70、IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平均高于癫痫3组,且P300潜伏期长于癫痫3组,而癫痫1组、癫痫2组的C-WISC评分低于癫痫3组,差异有统计学意义(P0.05)。Pearson线性相关分析显示,血清α-Syn、HSP70水平与C-WISC评分呈负相关,而与P300潜伏期及血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平呈正相关(P0.05)。结论与健康儿童相比,癫痫患儿血清α-Syn、HSP70水平明显增高,二者水平变化与认知功能、P300潜伏期及机体炎症密切相关。