利用双向启动子型RNA干涉载体构建随机RNA干涉文库的初步研究

目的:利用双向启动子型RNA干涉载体pRHU构建随机RNA干涉文库.方法:分别构建基于pRHU载体的绿色荧光蛋白EGFP和p53的干涉质粒,验证双向启动子型RNA干涉载体的可用性.设计合成满足pRHU载体特点的干涉文库随机模板,经PCR扩增克隆入pRHU载体,转化感受态细胞获取随机干涉文库.随机挑选20个菌落测序,评价随机文库质量.结果:双向启动子型RNA干涉载体pRHU能在哺乳动物细胞中对外源基因EGFP和内源基因p53进行有效的干涉,表明该载体是一个有效的干涉载体,可以用于构建随机RNA干涉文库.本研究采用的构建策略可在较短时间内,用50 μg pRHU载体获得4×106个克隆.随机挑选20个克隆测序结果表明均插入了GN17-19序列,并且不存在序列重复性.结论:采用本研究的构建策略可以简便快速地利用双向启动子型干涉载体成功构建随机RNA干涉文库,为进一步筛选功能基因奠定了基础.     

日本血吸虫8k CaBP基因启动子区的克隆与分析

目的克隆日本血吸虫8k CaBP(Sj8CaBP)基因启动子区并对该序列进行分析。方法提取日本血吸虫基因组DNA，并按Clontech Universal Genome Walker^TMKit的操作手册说明，建立日本血吸虫基因组DNA文库。根据手册要求及Sj8CaBP基因的cDNA序列，设计合成该基因染色体步移的特异性引物与试剂盒提供的端子引物进行巢式PCR。将得到的PCR产物克隆测序，测序结果用启动子区的分析软件及与其cDNA序列比对进行分析。结果得到的Sj8CaBP基因长度为1079bp(GenBank登录号AY262018)，该基因包含Sj8CaBP基因完整的开放阅读框(ORF)，包括1个内含子及2个外显子，在其5′端UTR区具有明显的启动子区，包括TATA盒及CAAT盒，没有发现GC盒及一些血吸虫基因启动子区所常见的AP—1(Active protein 1)结合位点。结论从日本血吸虫基因组文库中获得一个长1079bp的Sj8CaBP基因片段(GenBank登录号为AY262018)，经分析证明，该片段包含一个启动子区，具有TATA盒及CAAT盒的结构及1个内含子2个外显子．     

人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库的构建及鉴定

目的:构建人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定基础.方法:用Trizol方法提取人乙型肝炎肝硬化组织总RNA,并用mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化;反转录合成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用Sfi I酶切;将酶切产物进行分级分离,回收0.4 kb以上的cDNA组分,并与λTripl Ex2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增;鉴定扩增文库的滴度和重组效率;随机挑取11个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量.结果:未扩增文库滴度为1.03×106 pfu/ml,重组效率为97.24%,扩增后文库滴度为1.36×109 pfu/ml,重组效率为99.02%;用载体两端的通用引物进行PCR鉴定,插入片段平均长度为1.02 kb,含1 kb以上的占36.36%,0.5～1 kb的占63.64%.结论:已成功构建一高质量的人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定了基础.     

日本血吸虫8k CaBP基因启动子区的克隆与分析

目的 克隆日本血吸虫8kCaBP(Sj8CaBP)基因启动子区并对该序列进行分析。方法 提取日本血吸虫基因组DNA,并按Clontech Universal Genome Walker^TM Kit的操作手册说明,建立日本血吸虫基因组DNA文库。根据手册要求及Sj8CaBP基因的cDNA序列,设计合成该基因染色体步移的特异性引物与试剂盒提供的端子引物进行巢式PCR。将得到的PCR产物克隆测序,测序结果用启动子区的分析软件及与其cDNA序列比对进行分析。结果 得到的Sj8CaBP基因长度为1079bp(GenBank登录号AY262018),该基因包含Sj8CaBP基因完整的开放阅读框(ORF),包括1个内含子及2个外显子,在其5’端UTR区具有明显的启动子区,包括TATA盒及CAAT盒,没有发现GC盒及一些血吸虫基因启动子区所常见的AP-1(Activeprotein1)结合位点。结论 从日本血吸虫基因组文库中获得一个长1079bp的Sj8CaBP基因片段(GenBank登录号为AY262018),经分析证明,该片段包含一个启动子区,具有TATA盒及CAAT盒的结构及1个内含子2个外显子.     

应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩半后,随机挑取100个白色克隆及菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,95％的克隆中均有100－600bp的插入片段,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T／A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选,克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。     

硫霉素产生菌卡特利链霉菌A520基因文库的构建

以大肠杆菌／链霉菌穿梭柯斯质粒ｐＫＣ５０５为载体，构建了卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｌｅｙａ）Ａ５２０在大肠杆菌ＤＨ１的基因文库，重组质粒插入外源片段的概率在９５％以上，插入外源片段的大小为２０～３０ｋｂ。以链霉菌染色体分子量为１０４ｋｂ计算，由４０００个转化子构成的基因文库可以概括卡特利链霉菌Ａ５２０约９９％的基因组。用已经克隆的硫霉素环化酶基因上游的１．５ｋｂＤＮＡ片段作为探针杂交，从基因文库得到３２个阳性克隆。用利波曼链霉菌（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉ）中的ＩＰＮＳ基因作为探针杂交，从基因文库得到１个阳性克隆ｐＫＷ２０１／ＤＨ１，并为Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交进一步证实杂交片段在ＢａｍＨⅠ２．７ｋｂ片段上。用来自带小棒链霉菌（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）的克拉维酸生物合成途径中的环化酶基因ｃｓ２作为探针杂交进行筛选，得到１个阳性克隆ｐＫＷ３０１／ＤＨ１，说明所构建的基因文库比较完整，并为进一步研究硫霉素产生菌卡特利链霉菌Ａ５２０中抗生素生物合成基因打下了良好基础     

赖型钩体601株和017株基因文库的构建

黄疸出血群赖型钩体601株、017株DNA经EcoRI酶切消化，与EcoRI酶切消化和去磷酸化的pUC18连接后，转化大肠杆菌JM103，建成重组率为85％以上，分别含重组子8700个（601株）和12，000个（017株）的基因文库。随机选择的白色菌落的质位经酶切鉴定表明均含有大小不等的插入DNA片段。     

应用SEREX技术筛选和鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原

背景与目的 目前用于非小细胞肺癌诊断的标志物为数不多,为寻找更多的早期诊断和靶向治疗相关的标志物,本研究应用SEREX技术筛选与鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原.方法 使用非小细胞肺癌患者血清对人肺鳞癌和腺癌噬菌体展示文库进行生物淘选和SEREX筛选.PCR扩增阳性克隆插入片段后测序,结果 与GeneBank数据库中已知基因进行同源性比较,分析其生物学特性.结果用非小细胞肺癌血清对噬菌体展示文库进行筛选,共获得31个阳性克隆,测序后发现其代表15个基因,其中12个与已知cDNA序列同源,与肺癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另外3个未发现有同源基因,可能是新基因.结论 应用SEREX技术发现15个肺癌相关抗原和3个肺癌相关抗原的候选基因,为进一步的深入研究打下良好的基础.