人和羊IgG对噬菌体展示细菌免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库的体外进化筛选

目的 使用人和羊不同物种IgG来诱导噬菌体展示免疫球蛋白结合分子单结构域随机组合文库进行体外分子进化筛选,判断不同的Fc段构像是否具有特异的结合优势,同时探索其优势结合序列的组合特点.方法 通过PCR获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的A、B、D、E和链球菌(C和G群)蛋白G (SpG)的B2、B3各单结构域片段,构建...     

酵母双杂交筛选雄激素受体辅助调节因子267-α(ARA267-α)的相互作用蛋白

目的:通过酵母双杂交系统筛选与雄激素受体辅助调节因子267-α(androgen receptor-associated coregulator 267-α,ARA267-α)有相互作用的蛋白质,为研究ARA267-α的生理功能寻找证据和方向.方法:以能表达ARA267-α中4个PHD(p1ant homeodomain)和1个SET[Su(var)3-9,Enhancer-of-zeste,Trithorax]结构域的pGBKT7-PHD-SET重组质粒为"诱饵",采用酵母融合(yeast mating)方法筛选预转化的人脑cDNA文库.挑选阳性酵母菌落进行质粒提取、限制性内切酶分析和DNA测序.将测序结果在GenBank中进行核苷酸序列同源性比对,确定它们所对应的基因.通过再次酵母双杂交排除假阳性相互作用.结果:筛选cDNA文库共获得约600个阳性酵母菌落,随机挑选其中的65个菌落提取混合质粒.经过在氨苄青霉素培养盘中筛选,共得到43个文库pACT2-cDNA质粒.选取35个酶切片段不同的文库pACT2-cDNA质粒进行测序,测序结果比对揭示,35个cDNA插入片段来源于16种不同的基因.酵母双杂交证实其中RanBPM是ARA267-d的假阳性作用蛋白.结论:通过筛选cDNA文库发现ARA267-α可以与多个不同的蛋白质相互作用,这提示ARA267-α可能是一个具有多种生理功能的蛋白分子,而RanBPM极可能是一个转录因子.     

人肝癌细胞定向克隆表达cDNA文库的构建及鉴定

为克隆人肝癌相关基因，本实验从提取人肝癌细胞总ＲＮＡ入手，分离其ｍＲＮＡ。以ＮｏｔＩ／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８为引物合成双链ｃＤＮＡ，除去小于４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，经ＮｏｔＩ酶酶切，     

自人脑胶质瘤墓因文库克隆到一种未知墓因片段

利用神经髓鞘蛋自ＰＭＰ－２２基因（一种细胞生长休止期特异表达的基因）的编码区５’－及３’－序列为引物，藉ＰＣＲ方法自人脑胶质瘤ｃＤＮＡ文库中扩增出一个１８１ｂｐ的基因片段，并测定了其序列，在基因资料库中未查到任何同源基因存在，但该片段与蛋自激酶Ｃ墓因有５３．８％的同源性，提示它是一种新的未知基因的片段。     

丝状噬菌体表面呈现技术

对丝状噬菌体的结构、基因组及生命周期的深入认识,是丝状噬菌体表面呈现技术建立和发展的基础。可将外源基因片段插入噬菌体的基因Ⅲ(g3)或基因Ⅷ(g8)的先导序列的紧下游,使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面外壳蛋白gp3或gp8的N端,这样的呈现常能使表达的多肽保持生物活性,据此可用活的噬菌体直接方便、高效率地筛选目的基因或检测该基因产物的活性。这技术已被用于抗体基因文库、cDNA文库、随机多肽基因文库和突变基因文库的构建和筛选等方面。     

原代培养人毛乳头细胞cDNA酵母表达文库的构建和鉴定

Objective To construct yeast cDNA expression library of human dermal papillae cells (DPCs) in primary culture.Methods Human dermal papilla cells (DPCs) were isolated by two-step digestion method and cultured in DMEM medium.Total RNA was extracted from primary DPCs that exhibited an aggregative behavior in culture,then,cDNA was synthesized and amplified by using CloneMinerTM cDNA Library Construction kit to construct primary cDNA library and yeast cDNA expression libary.Results The average titer and total clones were 7.0×106 colony forming units(cfu)/ml and 1.4×107 cfu respectively in the primary library,5.5×106 cfu/ml and 1.1×107 cfu respectively in the yeast expression library.The average insert size Was 1.2 kb and the recombination rate was above 95%.Conclusions The yeast cDNA expression library of DPCs in primary culture has been successfully constructed.which will lay a foundation for screening proteins interacting with HSPC016 gene in DPCs with yeast two-hybrid system.     

酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前S1相关蛋白的研究

目的　利用酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前 S1 (pre S1 )蛋白相关蛋白 ,以利于探讨前 S1 蛋白在乙型肝炎病毒的入胞机制。　方法　以 HBV DNA阳性血清为模板通过PCR法扩增含 Eco R 与 Pst 酶切位点的 pre S1 基因序列 ,p AS2 - 1载体及 pre S1 基因 PCR产物经双酶切并连接 ,转化到大肠杆菌 JM10 5 ,对重组质粒 p AS2 - 1- pre S1 进行序列测定。乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母菌 AH 10 9,以Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。将p AS2 - 1- pre S1 及正常成人肝细胞 c DNA文库共转化酵母细胞 ,通过选择性培养、L ac Z活性测定筛选阳性菌落 ,分离实验及交合实验排除假阳性 ,PCR扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定 ,结果提交 NCBI的 BL AST应用程序 ,在Gene Bank 数据库查询其同源序列。　结果　重组质粒p AS2 - 1- pre S1 经序列测定含有完整的 pre S1 基因片段 ,Western Blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的pre S1 - BD蛋白 ,p AS2 - 1- pre S1 及正常成人肝细胞 c DNA文库共转化酵母细胞后 ,在 5× 10 6 转化子中 ,经选择性培养共长出 97个菌落 ,17个为 L ac Z阳性菌落 ,分离实验及交合试验筛选出 1个阳性菌落 ,PCR扩增产物经 Gen Bank数据库查询与人类初期多肽相关复合体 α     

肝细胞癌相关肿瘤抗原基因的筛选与分析

目的 筛选和分析肝细胞癌相关的肿瘤抗原。方法 用肝细胞癌组织构建cDNA表达文库，通过重组cDNA表达文库血清学分析法，用自体患者和异体患者的血清对文库进行筛选。将所得阳性噬菌体克隆体内剪切获得其pBK-CMV噬菌粒。通过限制性核酸内切酶鉴定插入cDNA片段，并作测序和生物信息学分析。同时将阳性克隆中的LIMS1插入片段进行原核表达。结果 自体血清筛选得到14种基因，异体筛选获得11种基因，两组中均筛选到kinectin，共有24种肝细胞癌相关的肿瘤抗原基因。其中有8种基因目前还不清楚其功能，其余16种基因根据确定的或者推断的功能可以分成8组。LIMS1原核重组蛋白表达成功。结论 本研究为肝细胞癌的免疫治疗提供了候选基因，并为理解肝细胞癌发生和发展的机制提供了线索。