利用抑制性消减杂交技术构建太空诱变宫颈癌细胞cDNA消减文库

目的利用抑制性消减杂交技术构建太空诱变宫颈癌细胞的消减文库,为进一步从基因表达水平研究空间特殊环境影响肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定基础。方法采用SuperSMART和SSH技术,以太空诱变的宫颈癌48A9细胞株作为Tester,地面正常对照组宫颈癌细胞株作为Driver,分离太空诱变的宫颈癌48A9细胞中差异表达的基因片段;连接T载体,转化宿主菌,构建太空诱变的宫颈癌48A9细胞cDNA抑制性消减文库。结果经蓝白筛选后随机挑取300个阳性克隆,以接头1和2R内侧序列为引物进行菌液PCR扩增鉴定阳性克隆,结果显示其中288个克隆有插入片段,阳性率为96％,大小分布在0．2—1．0kb间。结论本实验利用抑制性消减杂交技术成功的构建了高质量的太空诱变宫颈癌细胞消减文库,为进一步从基因水平阐明太空特殊环境对肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定了基础。     

赖型钩端螺旋体基因文库的构建及重组质粒pDC38的初步研究

应用质粒载体ｐＵＣ１８购建了黄疸出血群赖型钧体的基因文库，重组率８６％，重组子约１２０００个。以ＯｍｐＬ１基因片断作探针从该基因文库中筛出１０个阳性克隆，其中重组质粒ｐＤＣ３８与７型８株致病钩体（黄疸出血群赖型、大型、致热型、秋季型、澳大利亚型、波摩那型、流感伤寒群临海型）ＤＮＡ杂交有杂交信号；与非致病的双曲钩体、细丝体，大肠杆菌和２型问号钩体（爪哇型、拜伦型）ＤＮＡ无杂交信号。     

炭疽杆菌保护性抗原基因探针构建

首次在国内构建了炭疽杆菌ｐＸＯ１质粒基因文库，经ＰＣＲ方法和酶切分析筛选出保护性抗原基因重组子，同位素标记保护性抗原基因片段而制成探针．摸索出一种炭疽杆菌原位杂交膜处理法、杂交结果表明，探针特异性强、重复性好，可弥补常规检测法之不足。     

成人动脉和心脏cDNA文库的构建及新全长cDNAs的克隆

目的 :构建成人动脉和心脏互补脱氧核糖核酸 (c DNA)文库 ,克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸 (c DNAs)。　　方法 :应用成人动脉和心脏组织 ,采用 Stratagene的建库试剂盒构建 c DNA文库。将随机克隆 5 '端表达序列标签序列与 Gen Bank/ EMBL/ DDBJ数据库进行同源性比较 ,新的全长 c DNAs采用步移法完成全序列测定获得。　　结果 :所建动脉 c DNA文库包含 2 .4× 10 6个独立重组克隆 ,插入片段平均长度为 2 .0 kb;心脏 c DNA文库包含 1.0× 10 6个独立重组克隆 ,平均长度为 1.8kb。首批得到了 8条新的全长 c DNAs,已在 Gen Bank登记注册。　　结论 :构建符合要求的 c DNA文库是克隆新的全长 c DNAs的一条快速有效的途径。     

卵巢上皮性癌相关抗原的筛选和血清学检测

目的构建卵巢上皮性癌（卵巢癌）腹水肿瘤细胞的cDNA文库,从中筛选能用于卵巢癌早期诊断和免疫治疗靶点的卵巢癌相关抗原。方法用3例卵巢浆液性囊腺癌、1例卵巢黏液性囊腺癌、1例卵巢子宫内膜样癌患者的腹水肿瘤细胞构建cDNA文库,采用改良的重组克隆表达抗原的血清学鉴定（SEREX）技术与抑制性消减杂交（SSH）方法相结合的策略从文库中筛选卵巢癌相关抗原基因,并对其进行酶切鉴定、核苷酸测序分析。采用重组肿瘤抗原的微型血清学检测（SMARTA）法检测筛选出的卵巢癌相关抗原与96例卵巢癌患者和96例正常妇女的血清中相应自身抗体的阳性反应情况。结果经两轮血清学筛选和核苷酸测序分析,最终得到55个候选的卵巢癌相关抗原基因片段,代表45个基因,分为6类：（1）与已知的卵巢癌相关基因同源的基因,如BARD1基因等;（2）与其他肿瘤相关基因同源的基因,如TM4SF1基因等;（3）在一些特殊组织中表达的基因,如ILF3、FXR1基因等;（4）与一些特殊功能蛋白基因同源的基因,如TIZ、C1D基因等;（5）与胚胎来源的基因同源的基因,如PKHD1基因等;（6）其余为在基因库GenBank中无同源序列可比对的未知基因,如OV-189基因等。TM4SF1、C1D、BARD1、FXR1、OV-189基因的噬菌体重组融合抗原与卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率分别为28％、21％、23％、23％、31％,与正常妇女血清反应的阳性率分别为9％、6％、5％、8％、13％,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;TIZ、FXR1、OV-189基因的重组抗原与卵巢癌患者血清中相应IgM型自身抗体反应的阳性率分别为26％、28％、18％,与正常妇女血清反应的阳性率分别为8％、11％、7％,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。FXR1、OV-189基因的重组抗原与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率（分别为34％、46％）高于Ⅲ～Ⅳ期者（分别为16％、23％）,两者分别比较,差异均有统计学意义（P值分别为0．045、0．021）;OV-189基因的重组抗原与高分化卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率（为67％）高于中～低分化者（为26％）,两者比较,差异均有统计学意义（P=0．001）。TIZ、FXR1基因的重组抗原与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者血清中相应IgM型自身抗体反应的阳性率（分别为40％、46％）高于Ⅲ～Ⅳ期者（分别为18％、18％）,两者分别比较,差异均有统计学意义（P值分别为0．018、0．004）。当联合分析TM4SF1、C1D、TIZ、FXR1基因的重组抗原的相应IgG型自身抗体及TIZ、FXR1基因的重组抗原的相应IgM型自身抗体（即自身抗体谱）时,诊断卵巢癌的敏感度为66％,准确度为73％;将该自身抗体谱与CA125联合时,敏感度、准确度均有明显提高,分别为83％、80％。结论SEREX技术与SSH方法相结合筛选肿瘤抗原基因是一种行之有效的、能筛选出具有较高特异性肿瘤抗原基因的研究策略;TM4SF1、C1D、TIZ、BARD1、FXR1、OV-189基因的重组抗原在血清中的相应自身抗体可作为卵巢癌诊断的标志物,多个抗原的联合检测可提高诊断效率。     

大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库的构建

目的构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库，为进一步筛选、克隆按蚊免疫差异新基因奠定基础。方法以大劣按蚊～约氏疟原虫为实验模型，分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后24h的大劣按蚊作为T组和D组，采用抑制差减杂交方法和T／A克隆技术构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库。结果扩增差减cDNA文库获得2500余个白色阳性克隆，随机挑取白色克隆进行PCR扩增。92％的克隆中均有200～600bp的插入片段，测序显示，有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆。结论成功构建了大劣按蚊差异基因文库。     

利用果蝇转座子作载体构建土垢分枝杆菌变异基因文库的研究

目的　利用果蝇mariner转座子作为载体构建土垢分枝杆菌随机变异基因文库以筛选影响脂肪酸代谢的基因。　方法　将果蝇转座子mos1的末端反向重复序列置于卡那霉素抗性基因两侧 ,并将此种基因插入到M2 72B载体 ,用此载体转化土垢分枝杆菌 ,用Southernblot验证外源基因的插入。将变异的基因克隆在不同碳源的培养基上培养 ,筛选只在软脂酸上生长的菌落。　结果　初筛了 4 6 8个菌落 ,有 5个不能在软脂酸上生长 ,其中 2个在ICL基因上发生变异 ,3个在PCKA基因上发生变异。ICL为乙醛酸旁路所必须 ,PCKA编码糖异生的关键酶。　结论　研究证明该转座子载体用于基因变异有效 ,变异筛选分枝杆菌中与脂肪酸代谢的基因可行。     

外源蛋白在酵母中表达的糖化修饰及人源化改造

Pichia pastoris(为毕赤酵母属中的一种)是目前广泛用于分泌表达重组蛋白质的宿主细胞，许多有着药用价值的蛋白质为N-糖基化修饰。因此，要求表达宿主能够产生在结构和功能上与人相同的N-连寡糖。最近一些研究组报道了利用组合基因文库来改造Pichia pastoris N-糖基化路径，从而产生同哺乳动物细胞N-糖基化蛋白质一样的N-连寡糖。该类研究的成功将可能广泛用于蛋白质功能的研究，并极有可能掀起运用Pichia pastoris生产药用糖蛋白的热潮。     

血吸虫感染抗性人血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的分析血吸虫感染抗性人血清中起免疫保护作用抗体针对的日本血吸虫蛋白抗原谱,为日本血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原分子。方法采集血吸虫流行病区感染抗性人血清,免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对获得的阳性克隆核苷酸进行序列分析,并利用软件对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果共筛选出29个持续阳性克隆,对其进行测序,获得25个基因,包括5种已知基因(其中日本血吸虫肌球蛋白12个、丝氨酸蛋白酶抑制剂2个、细胞色素b1个、延伸因子1-α1个和线粒体编码区1个)和5个未知基因,软件分析显示不同抗原分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能编码潜在的日本血吸虫病疫苗分子,其中日本血吸虫肌球蛋白为主要抗感染蛋白分子。