人血小板衍生生长因子BB原核表达及生物学活性鉴定

目的 表达人血小板衍生生长因子(PDGF)BB蛋白并进行生物学活性鉴定.方法 基因扩增方法获得人PDGF-B基因;原核表达PDGF-BB蛋白,并纯化、复性;免疫印迹分析重组蛋白的免疫原性;应用培养的大鼠成骨细胞对其生物学活性进行鉴定.结果 扩增出327bp目的基因,与预期结果吻合,DNA序列分析正确.SDS-PAGE和免疫印记检测表明获得新生蛋白的分子量及免疫原性均与预期符合.体外细胞学鉴定表明,获得的rhPDGF-BB可明显促进大鼠成骨细胞的增殖和DNA复制,表明重组的PDGF-BB具有较好的生物学活性.结论 PDGF-B成熟肽基因克隆成功并成功地在大肠杆菌中实现了高表达.复性后细胞学MTT和FCM鉴定表明获得的rhPDGF-BB具有较好的生物学活性,为生产活性PDGF-BB蛋白及其在促进骨组织和创伤修复方面的进一步功能研究奠定了基础.     

在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M_2及M_5受体重组突变体

目的为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台。方法用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记。将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白。Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能。结果通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体。将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变。Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力。结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究。     

植物细胞色素P450基因与功能研究进展

细胞色素P450是一种血红素结合蛋白,在生物界广泛存在.自从1958年从小鼠肝脏微粒体中分离到第一个细胞色素P450以来,对细胞色素P450的结构、分子克隆、基因表达机制、功能鉴定及其应用方面的研究取得了重大进展.文章简要总结了植物细胞色素P450基因克隆和功能研究的最新进展.     

溶菌酶在医药领域的研究进展

溶菌酶是一类无毒无害的蛋白质,具有良好的抗菌消炎作用。本文综述了溶菌酶的结构特点、作用机制、分离纯化、基因克隆等方面的研究现状,并对其医药应用和发展前景做了展望。     

植物皂苷生物合成中UGT功能研究进展

植物皂苷(Saponins)是广泛存在于绝大多数植物体中不可或缺的一类次生代谢产物。其中多种植物皂苷具有重要的药理活性。尽管皂苷的生物合成途径还未彻底解析,但近年来,皂苷生物合成途径研究,尤其是合成途径下游多基因家族编码酶催化的反应,取得了很大进展。目前,已在个别植物中克隆到了催化个别单体皂苷生物合成的UGT基因,其功能研究取得了一定进展。本文就皂苷合成途径下游催化皂苷元糖基化的糖基转移酶基因克隆和功能研究做一综述,为加快皂苷生物合成途径的解析提供借鉴。     

兔转化生长因子-β2基因的克隆及其表达的检测

目的　克隆兔转化生长因子 β2 (TGF β2 )基因 ,并获得其在兔重要脏器及角膜中的表达。方法　利用不同物种的相似序列设计相关引物 ,制备兔肝组织的RNA并逆转录 ,RT PCR技术获得TGF β2 基因蛋白编码区序列后克隆 ,RT PCR半定量及荧光定量PCR检测TGF β2 在兔重要脏器及角膜中的表达。结果　成功地克隆了兔TGF β2 的蛋白编码区序列 ,测序证实和人、大鼠及小鼠具有高度的同源性 ,含有TGF β2 的保守结构域 ,TGF β2 基因在兔心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺和角膜组织中均有不同程度表达。结论　利用同源序列克隆进化上保守的基因是简捷快速的方法。获得兔TGF β2 的基因有助于进一步研究其在机体重要脏器纤维化、肿瘤以及角膜疾病中的作用     

GDNF基因的克隆及重组质粒pAd-GDNF的构建

目的克隆大鼠胶质细胞源性营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因,构建重组质粒pAd-GDNF。并观察GDNF基因在3周龄大鼠卵巢的表达。方法从3周龄大鼠卵巢组织中提取总RNA,用PT-PCR方法扩增出两个分别约668bp、590bp的片段,并将其中约668bp的片段克隆到载体pAdTrack-CMV中,进行酶切鉴定和序列分析。结果证实成功克隆到大鼠GDNF基因。出生后发育期成年大鼠卵巢组织表达两种GDNF mRNA,其中长的mRNA片段强于短的片段。结论出生后发育期成年大鼠卵巢组织GDNF基因表达两种mRNA,可能主要以长片段GDNF mRNA发挥其生理作用;克隆到正确的大鼠GDNF基因。并构建出重组质粒pAd-GDNF,为下一步的研究打下基础。     

竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆及生物信息学分析

目的 克隆竹节参Panax japonicus鲨烯环氧酶基因（squalene epoxidase,PjSE）的全长cDNA序列,进行生物信息学分析和原核表达。方法 设计特异性引物,从竹节参中克隆得到PjSE序列;以PjSE基因序列作为输入数据,利用多序列同源比对等生物信息学分析工具进行序列分析;构建重组原核表达载体pCold-PjSE,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;采用实时荧光定量PCR技术分析该基因在竹节参不同组织中的相对表达量。结果 PjSE基因开放阅读框长度为1884 bp,编码627个氨基酸,PjSE蛋白相对分子质量为68 639.49,初步预测其具有跨膜结构域,可能定位在叶绿体上;聚丙烯凝胶电泳结果显示诱导表达蛋白的相对分子质量大小与预期结果一致;该基因在竹节参叶中表达量最高,须根次之,根中表达量最低。结论 PjSE基因的克隆、生信分析及原核表达研究,不仅有助于丰富竹节参中该类功能蛋白的种类和数量,完善竹节参皂苷类成分的生物合成途径,也为后期开展竹节参皂苷的异源合成提供了可供选择的关键基因元件。     

华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析

目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析。方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的c DNA全长,并通过DNAMAN软件和Ex PASy在线分析等对其进行了生物信息学分析。结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的c DNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80%以上。结论:获得了AsPAL c DNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础。     

丹参晚期胚胎富集蛋白基因的克隆及表达模式分析

目的克隆丹参晚期胚胎富集蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法对丹参转录组数据库进行BLAST同源性比对,发现一条新的与LEA基因家族同源性较高的序列,命名为Sm LEA2,Gen Bank登录号为HQ676610。进一步利用PCR和RT-PCR技术从丹参g DNA以及c DNA水平克隆得到了Sm LEA2基因全长。采用软件分析蛋白质结构性质和系统进化关系。利用实时荧光定量PCR的方法对不同部位、不同发育时期以及不同处理丹参的Sm LEA2表达量进行检测。结果获得Sm LEA2 g DNA长1 961 bp,由1个外显子和1个内含子组成,并且内含子位于ATG的上游;开放阅读框长为960 bp,共编码319个氨基酸。生物信息学分析显示,Sm LEA2是存在于细胞质中的亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽,其相对分子质量为35 340,等电点为4.77。该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,并且在茎中的表达量最高。随着花的成熟和种子的发育,该基因表达量逐渐升高,并且该基因的表达受茉莉酸甲酯(Me JA)以及脱落酸(ABA)的诱导作用影响。结论克隆得到的丹参Sm LEA2可能参与种子发育过程,并在丹参防御反应中发挥作用。