利用PCR技术构建GM-CSF/Fc_(γ2)~-融合蛋白真核表达载体

目的　对融合基因GM -CSF Fcγ2 进行定点突变 ,去除其补体结合位点 ,构建GM -CSF Fcγ2-融合蛋白真核表达载体。方法　通过设计突变引物 ,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM -CSF Fcγ2-。并通过T -A克隆策略 ,把突变后的融合基因GM -CSF Fcγ2-重组到真核表达载体pRc CMV2中 ,构建真核表达质粒pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-并经过酶切和测序确证。结果　成功对融合基因GM -CSF Fcγ2-进行了突变 ,构建了真核表达载体pRc CMV2 GM -CSF Fcγ2-。结论　利用该PCR方法进行基因定点突变可行     

利用PCR技术构建GM—CSF／Feγ2^—融合蛋白真核表达载体

目的 对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行定点突变,去除其补体结合位点,构建GM－CSF／Feγ2^-融合蛋白真核表达载体。方法 通过设计突变引物,利用PCR定点突变技术扩增融合基因GM－CSF／Feγ2^-。并通过T－A克隆策略,把突变后的融合基因GM－CSF／Feγ2^-重组到真核表达载体pRc/CMV2中,构建真核表达质粒pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-并经过酶切和测序确证。结果 成功对融合基因GM－CSF／Feγ2^-进行突变,构建了真核表达载体pRc/CMV2/GM－CSF／Feγ2^-。结论 利用该PCR方法进行基因定点突变可行。     

人截断型LBP基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的 构建人N端截断型脂多糖结合蛋白（tLBP)基因的杆状病毒表达载体,为后续的蛋白表达及其抗内毒素保护作用研究奠定基础。方法 采用PCR技术从人全长LBP基因cDNA中扩增长度为695bp的基因片段,经pGEM-T载体亚克隆筛选和序列分析后,应用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统,基因重组和外源基因转座分别构建转移质粒pFASTBACtLBP和穿梭质粒pBac-midtLBP。结果 经PCR、琼脂糖凝胶电泳、酶切分析及序列测定,所克隆的基因片段为700bp左右的tLBP,并证实其目的基因重组载体发生了特异转座和病毒重组。结论 本实验成功克隆了tLBP目的基因片段并构建其杆状病毒表达载体。     

人组织激肽释放酶基因的克隆及测序分析

目的 克隆中国人组织激肽释放酶基因,为开展基因治疗高血压研究奠定基础。方法 提取人胰腺组织总RNA,逆转录后进行PCR扩增。将PCR产物回收、插入质粒KS,酶切鉴定后双向测序分析。结果 本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比,有一个碱基不同,同源性为99.8%。结论 克隆的中国人组织激肽释放酶基因可用于基因治疗等深入研究工作。     

重组人肝细胞生长因子基因的克隆

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人胎盘组织内成功地扩增全长肝细胞生长因子（ＨＧＦ）ｃＤＮＡ基因（２ １８４ｂｐ）,并将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体,经限制性核酸内切酶ＮｄｅⅠ,ＢｇｌⅡ,ＨｉｎｄⅢ,ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ的酶谱分析和ＤＮＡ测序分析证实。再将其亚克隆至逆病毒载体ｐＬＮＬ－ＸＨＣ,可进一步用于基因表达和基因治疗的研究。     

人肺癌相关抗原的基因克隆

目的克隆人肺癌相关抗原的基因。方法用λｇｔ１１Ｓｆｉ－Ｎｏｔ定向克隆载体构建人肺鳞癌细胞系Ｌ－７８的ｃＤＮＡ文库,并以抗人肺癌单抗ＡＬＴ－０４为探针进行了筛选。对名为ｈｌｃ－１４的ｃＤ－ＮＡ克隆作了测序分析与进一步研究。用重组的ｐＸＪ４１－ｈｌｃ１４质粒转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过免疫组化法对克隆基因进行了表达检测与鉴定,还观察了转染细胞的软琼脂集落形成能力。结果建成１．４×１０６ｐｆｕ／ｍｌ人肺癌ｃＤＮＡ文库,经过四轮免疫学筛选获得６个ｃＤＮＡ克隆,最大的ｃＤＮＡ克隆为ｈｌｃ－１４,长９５４ｂｐ。对该克隆的测序结果与基因库资料比较,未发现同源序列。ｈｌｃ－１４ｃＤＮＡ转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有明显的肺癌相关抗原表达,并且在软琼脂中的集落形成能力增强。结论ｈｌｃ－１４是一个新的肺癌相关抗原的ｃＤＮＡ序列。这一序列的发现为阐明肺癌的发病机理、探索肺癌基因治疗的靶基因提供了新的线索     

sTRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆TRAIL基因的95-281位(sTRAIL)，构建表达载体，建立原核表达体系，优化诱导表达的条件。分离人外周血淋巴细胞，提取总RNA，RT-PCR，克隆sTRAIL的cDNA，构建原核表达载体，优化IPIG诱导的条件。结果：(1)克隆了TRAIL基因95-281位的cDNA，DNA测序结果与报道的一致。(2)构建了sTRAIL基因的原核表达载体，酶切结果与预期的一致。(3)转化宿主菌，优化IPIG诱导条件，发现3mmol/L，诱导3～4h表达最好。sTRAIL基因的克隆及表达为下游中试发酵及纯化奠定了上游的基础，也为研究TRAIL抗肿瘤的机制提供了可能。     

人PTEN基因表达载体的构建及其在U251细胞中的表达

背景与目的:克隆人野生型和突变型PTEN的cDNA并构建其表达载体,探讨该表达质粒在人星形胶质瘤细胞U251中的表达情况.材料与方法:分别从新鲜胎盘组织和结肠癌组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增人野生型和突变型PTEN基因全长cDNA,分别克隆入pMD 18-T载体上,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸序列分析.再分别将两段基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体,转染入U251细胞.结果:成功克隆了人野生型及突变型PTEN cDNA并成功构建其表达载体,发现突变型PTEN蛋白对细胞生长无明显抑制作用,而野生型PTEN蛋白对细胞生长有明显抑制作用.结论:PTEN可能能抑制肿瘤细胞生长,为后进一步开展PTEN对肿瘤相关功能的研究奠定基础.     

人类TAP2基因克隆及真核表达质粒的构建

抗原处理相关转运体(transporter associated with antigen processing,TAP)属于ABC(ATP-binding cassette)超家族成员,由TAP1(75 kD)和TAP2(71 kD)形成异二聚体,负责抗原肽从胞浆到内质网的转运,在MHC Ⅰ类分子的抗原处理及提呈过程中发挥重要作用.     

人白细胞介素17(IL-17)的克隆及其在大肠杆菌中的表达

树突状细胞(DC)是一类能特异性启动T淋巴细胞介导的免疫反应的抗原提呈细胞,与其它抗原提呈细胞不同的是,树突状细胞能激活初始型T淋巴细胞(naive T cells).近年来,人们试图通过刺激血液中的前体细胞以提高DC的量.最近,有学者通过GM-CSF、IL-4及MCM的培养单个核细胞中获得了DC.本研究对此法加以改良并从恒河猴血中获得了形态、表型及功能均与人成熟DC非常类似的DC.去除了T细胞的单个核细胞在含有1%人血清及GM-CSF和IL-4的培养基中培养,在第7天,50%的培养基换成单核细胞的条件培养基MCM.此培养基是获得成熟的具有免疫刺激作用的DC所必需的,这样可从2Oml血中获得0.5-1.0×10~6DC.对这些DC与在同样培养基中培养产生的巨噬细胞的比较表明,这些DC刺激同种异体T细胞的能力较巨噬细胞明显增强,而且这些DC的形态和表型很典型且能表达高水平的p55及与细胞内CD68.对比之下,贴壁的巨噬细胞表达非常低水平的p55及高水平的弥漫性CD68,用此方法制备的恒河猴