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41.
42.
目的:抗CD3单克隆抗体(WuT3)可变区基因克隆及序列分析。方法;采用RT-PCR技术,从WuT3杂交瘤细胞总RNA中扩增VH,VL片段,经酶切后通过链接反应构建重组克隆载体,测序鉴定。结果:通过国际联机检索发现VH,VL基因与Ig同源,分别符合小鼠IgVH,Vк基因特征。VH基因属于鼠重链VH第ⅡB亚类,全长363bp,可编码121个氨基酸;VL基因属于鼠к轻链第Ⅲ亚类,全长330bp,可编码110个氨基酸,结论:成功获得WuT3单抗的重,轻链可变区基因。 相似文献
43.
目的:克隆人白细胞介素-3(hIL-3)基因cDNA,构建其真核表达质粒pcDNA3/hIL-3。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增IL-3基因cDNA,通过T/A克隆法,首先构建pUCm-T/hIL-3,然后构建其真核表达型载体pcDNA3/IL-3。结果:pUCm-T/hIL-3内插入片段序列与hIL-3基因序列一致;pcDNA3/IL-3经酶切鉴定与预期结果一致。结论:成功完成了hIL-3基因克隆和pcDNA3/IL-3真核表达质粒的构建。 相似文献
44.
登革病毒2型NS1蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果观察 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 以登革病毒 2型 (denguevirus2 ,DV2 )非结构蛋白 (non structrulprotein 1,NS1)为靶基因 ,构建DV2 NS1的候选DNA疫苗 ;并探讨其在小鼠体内诱导特异性体液免疫和细胞免疫的作用。方法 将登革病毒 2型NS1 NS2a基因片段克隆至含AG强启动子的真核表达载体pCXN2上 ,构建成重组体pCXN2 NS1 NS2a。在体外将重组质粒转染Cos 7细胞 ,间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达。大量提取空质粒和重组质粒 ,进行动物免疫实验。结果 重组质粒可在真核细胞中有效地表达NS1蛋白。免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对NS1蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫。末次免疫前已有抗体产生 ,4周后达高峰。抗体依赖补体介导的溶细胞作用 (antibody dependentcomple ment mediatedcytolysis,ADCC)试验结果显示产生的抗体在体外具有特异的杀细胞作用。淋巴细胞增殖实验结果显示 ,实验组小鼠的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异有显著性。流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞变化情况 ,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比 ,CD4 + 、CD8+ 细胞水平有较大升高 (P <0 .0 1)。动物保护性实验结果显示 ,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时 ,有 6 6 .6 %的免疫鼠受到保护。结论 NS1 NS2a基因重组质粒免疫小鼠可以诱 相似文献
45.
应用长链RT-PCR法扩增我国登革2、4型病毒株全长cDNA 总被引:3,自引:1,他引:3
目的:采用长链RT-PCR技术扩增登革2型及4型病毒基因组全长cDNA,为构建登革病毒全长cDNA克隆、表达,深入阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法:根据已测定的登革2、4型病毒全基因组序列,设计上下游引物。从感染登革病毒的乳鼠脑中提取病毒基因组RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增。为检验扩增产物的特异性,以PCR产物为模板扩增覆盖基因组的10个片段。将含有复杂二级结构的5′非编码区扩增片段,在377A型自动测序仪进行序列分析。结果:扩增出登革2、4型病毒基因组全长近11kb cDNA分子,非编码区测序结果表明扩增产物为登革2、4型病毒所特有。结论:利用长链RT-PCR首次成功扩增出登革病毒全长cDNA分子。 相似文献
46.
以正常人血淋巴细胞染色体DNA为模板,PCR扩增出短体前β神经生长因子编码基因。将所得基因片段重组于M13噬菌体载体,筛选得到含中国人prepro-β-NGF基因的克隆。采用Sanger单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列,该序列与国外文献所报道的仅有一个碱基不同。将该基因亚克隆于真核表达载体pEV1,经转染哺乳动物细胞BHK后,在培养上清中检测到了成熟型β-NGF。 相似文献
47.
人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化 总被引:5,自引:0,他引:5
目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。 相似文献
48.
9.1C3分子是一种参与NK、巨噬细胞及LAK细胞杀伤过程的重要细胞表面分子,主要表达于外周血单个核细胞表面。本文运用分子生物学技术,从分泌9.1C3MCAb的杂交瘤细胞中提取总RNA,经反转录、PCR分另11分离了9.1C3McAb轻链可变区(VL)基因及重链可变区(VH)基因,并用全自动荧光DNA序列分析仪对9.1C3VH、VL基因序列进行了分析。结果表明:9.1C3VH基因为351bP,编码117aa残基,9.13VL为324bP,编码108aa残基;从推导出的氨基酸序列分析证实9.1C3VH、VL序列均符合小鼠lg可变区的氨基酸序列特征;根据Kabbat分类体系,9.1C3VH隶属Ig重链第Ⅱ(C)亚组,9.1C3VL隶属小鼠IgK链第Ⅴ亚组。9.1C3VH、VL基因的克隆成功为其单链抗体的构建、表达奠定了良好的物质基础。 相似文献
49.
血管生成素 (angiogenin ,ANG)是存在于正常血浆及实体肿瘤组织中的一种属于核糖核酸酶超家族[1] ,分子量为 14 1kD、pI9 5的蛋白质 ,基因定位于染色体 14q11。ANG是一种能有效促进新生血管形成的刺激因子 ,具有很强的促血管生成作用。因此开展ANG的相关研究在损伤修复及组织工程学中极有意义。本文旨在构建ANG真核表达载体 ,转染人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) ,研究其在HUVEC中的表达情况 ,为进一步研究ANG对HUVEC生长状况的影响以及ANG在组织工程学中的应用奠定基础。1 材料与方法1 1 材料 EcoRⅠ、BamHⅠ为Promega产品 ,… 相似文献
50.
利用SMART技术构建了人胎脑cDNA文库,通过大规模测序筛选出一条1645bp的人类cDNA。此cDNA含有一个888bp的开放阅读框(ORF),编码一个296个氨基酸的蛋白质,预测分子量34.0KD。与目前数据库中序列比较,该cDNA编码的蛋白质与蛋白质二硫键异构酶的同源性达36%,命名为类蛋白质二硫键异构酶(PDI-L)基因,多组织Northern blot分析显示PDI-L cDNA在心、脑、肝肾等组织中均有表达,该cDNA的读框片段正确插入到改造后的pBV220表达载体中,获得了预期的表达蛋白。 相似文献