白血病细胞线粒体超微结构及其蛋白质双向电泳分析

探讨白血病细胞线粒体（mt）形态、结构和功能的异常与mt蛋白组分变化间的可能的关系。方法采用离心法分离纯化了可移植性小鼠腹水型白血病细胞（L7811）及正常615纯系小鼠胸腺细胞线粒体，对其超微结构进行了电镜观察。结果对它们各自蛋白质双向电泳图谱分析后发现在PH4．5～6．5，MW15～35KD范围内正常对照有8个蛋白质斑点在L7811l白血病细胞线粒体电泳图谱相应位置未观察到，而在PH6左右、MW10～17KD区域内白血病样品有3个蛋白质斑点，在正常对照的电泳图谱相应区域也未观察到。结论白血病细胞与正常对照细胞相比线粒体在超微结构和蛋白质组成上均有明显差异。     

甲状旁腺激素间歇性应用对大鼠成骨细胞分泌组的影响

目的 利用蛋白质组学技术研究甲状旁腺激素(PTH1-34)对大鼠成骨细胞分泌组的影响,为进一步研究唧促成骨作用机制、寻找新的骨代谢调节因子打下基础.方法 将大鼠成骨细胞分为PTH刺激组和对照组分别培养,收集第三周期6h末和24h末的无血清培养液,用透析-丙酮沉淀法富集培养液中的分泌蛋白质,然后通过双向电泳寻找差异蛋白,再通过质谱分析和数据库检索鉴定两组样品中差异蛋白的种类和性质.结果 6h末和24h末PTH刺激组的分泌组均有明显改变,初步鉴定其中23个差异表达蛋白,发现它们分别属于细胞骨架蛋白、翻译调控相关蛋白、蛋白降解相关蛋白、信号转导相关蛋白、热休克蛋白/分子伴侣、抗氧化酶、胰岛素样生长因子结合蛋白及与糖、脂代谢相关的酶等.结论 PTH间歇性应用可使成骨细胞分泌组发生明显改变,这些蛋白可能与PTH促成骨作用相关,本研究为进一步研究PTH促成骨机理、寻找新的骨代谢调节因子提供了实验依据.     

结核病患者血清蛋白质组学研究实践的启示

H37Rv全基因组序列图[1],标志着结核病研究进入后基因组时代.以双向电泳、生物质谱和生物信息学为核心技术的蛋白质组学开启了后基因组时代研究之门.蛋白质作为生物生命活动的直接体现者,必将体现于结核病发生、发展的各个环节和方面,为探讨结核病血清学诊断新型标志物,笔者进行了结核病血清蛋白质组学的相关研究.在研究过程中,笔者获益匪浅,现总结报告如下.     

突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化

背景：双向电泳是突触蛋白质组学分析中最流行最通用的蛋白质分离方法之一.但文献中突触蛋白双向电泳对线性固相pH梯度（immobilized pH gradients,IPG）胶条和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroph-oresis,SDS-PAGE）浓度的选择很多,尚未见统一标准.目的：对突触蛋白双向电泳的IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度进行优化,以获得高质量的突触蛋白双向电泳图谱.方法：以大鼠海马突触蛋白为试材,比较pH 5.0-8.0与pH 3.0-10.0线性IPG胶条,线性与非线性pH 3.0-10.0IPG胶条,以及单一浓度10％与12％ SDS-PAGE对双向电泳的影响.此外,还使用计算机检索了1989至2013年中国知网及PubMed数据库中关于突触蛋白双向电泳的文献,对文献中选择的IPG胶条、SDS-PAGE凝胶浓度进行了统计和评价,并总结了突触蛋白在不同pH值IPG胶条和不同浓度SDS-PAGE凝胶的双向电泳图谱上的分布特征.结果与结论：结果表明,使用pH 3.0-10.0的非线性胶条及单一浓度10％ SDS-PAGE凝胶进行突触蛋白双向电泳较为适宜,电泳图谱质量好,实验操作便利;同时还推荐合并使用pH 4.0-7.0和pH 6.0-11.0的IPG胶条,以及线性梯度浓度9％-16％ SDS-PAGE凝胶,也适用于突触蛋白双向电泳分析.     

肥胖者高密度脂蛋白亚类组成与脂蛋白酯酶基因多态性的关系

目的探讨肥胖者高密度脂蛋白亚类组成与脂蛋白酯酶基因内含子8 HindⅢ酶切位点多态性的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片长多态性和双向电泳免疫印迹检测法,分析95例肥胖者和144例体质指数正常者的脂蛋白酯酶基因内含子8 HindⅢ多态性、高密度脂蛋白亚类组成及相对百分含量。结果肥胖组和对照组均以H H 基因型为主。肥胖组血浆甘油三酯、载脂蛋白B100、CⅡ、CⅢ、E、前β1高密度脂蛋白水平及甘油三酯/高密度脂蛋白胆固醇较对照组增加,而高密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白AI、高密度脂蛋白2b水平及载脂蛋白E/CⅢ明显降低(P<0.05)。肥胖组H H 基因型者与H-H-者比较,血清甘油三酯、载脂蛋白B100、前β1-高密度脂蛋白、高密度脂蛋白3b含量显著升高,而载脂蛋白E/载脂蛋白CⅢ、高密度脂蛋白2a和高密度脂蛋白2b显著降低;肥胖组H H-基因型者与H-H-者比较,载脂蛋白B100、前β1高密度脂蛋白和高密度脂蛋白3b含量显著升高,而载脂蛋白E/CⅢ和高密度脂蛋白2a显著降低(P<0.05)。对照组H H 及H H-基因型者血清载脂蛋白CⅡ、载脂蛋白CⅢ和高密度脂蛋白3a含量均较H-H-者显著升高,而载脂蛋白E/载脂蛋白CⅢ、高密度脂蛋白2a、高密度脂蛋白2b显著降低(P<0.05)。结论脂蛋白酯酶基因H H 基因型与肥胖者增高的甘油三酯水平有关。中国人脂蛋白酯酶基因HindⅢ酶切位点多态性与高密度脂蛋白亚类的组成和分布相关,H 等位基因携带者高密度脂蛋白颗粒有变小的趋势,且肥胖者更为明显,表明H 等位基因携带者高密度脂蛋白成熟代谢障碍。     

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究

目的 运用蛋白质组学的方法,比较正常人及早期活动性类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)蛋白质的差异表达,寻找RA疾病相关致病蛋白质.方法 选取9例早期活动期RA患者以及9名健康成年志愿者,用淋巴细胞分离液分离PBMCs,抽提PBMCs中的蛋白,采用同相pH梯度(IPG)双向凝胶电泳(2-DE)分离正常人及RA患者PBMCs总蛋白质.凝胶经考马斯亮蓝染色显色后,PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定,运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法验证部分差异蛋白质.结果 获得RA患者及正常人PBMCs蛋白质双向凝胶电泳图谱,平均蛋白质点数分别为556和579,匹配率分别为89.4%和 88.5%,通过比较分析,差异表达蛋白质点数为23,选取18个点进行质谱鉴定,成功鉴定14个蛋白质,其中a-肌动蛋白、纤维蛋白素原a-链、载脂蛋白A-I(ApoA-I)等9个蛋白质点在RA中表达上调,硫氧还蛋白-2、谷胱甘肽S-转移酶等6个蛋白质点在RA中表达下调,这些差异蛋白质的功能涉及物质代谢、抗氧化、信号传导、能量产生及细胞骨架.并用RT-PCR方法验证差异蛋白质ApoA-I.其结果与上述蛋白质差异表达结果相符.结论 在RA患者PBMCs中存在着差异表达蛋白质,这些差异蛋白质可能是RA发病的内在因素.其RT-PCR结果与蛋白质差异表达相符,证明蛋白质组研究的可靠性.     

结核分枝杆菌广泛耐药株与耐多药株菌体蛋白质组学比较研究

目的比较和分析结核分枝杆菌广泛耐药（XDR）与耐多药（MDR）菌株在菌体蛋白质表达水平上的差异,并寻找与XDR相关的蛋白质点。方法利用双向凝胶电泳分离XDR、MDR菌株以及H37Rv标准菌株菌体蛋白质,通过计算机图像分析软件分析各菌株之间在菌体蛋白质表达水平上的差异性,并进行质谱分析。结果 XDR与MDR以及H37Rv菌株之间在菌体蛋白质表达水平上存在明显差异;与XDR相关的28个差异（新增、缺失、上调、下调）表达的蛋白质点中,质谱分析鉴定出5个相关的蛋白质点。结论结核分枝杆菌XDR与MDR菌株在菌体蛋白质表达水平上存在明显差异,为进一步研究XDR菌株耐药机理奠定了基础。     

正常和退变腰椎间盘蛋白质的双向电泳和质谱鉴定

背景:近年来对于退变腰椎间盘组织蛋白质成分改变的研究取得了很大进展,但是对于正常和退变腰椎间盘整体蛋白质成分改变的分离和差异鉴定却鲜见报道.目的:建立正常和退变腰椎问盘蛋白质的双向电泳图谱,鉴定差异表达蛋白,探讨腰椎间盘退变的生物学机制.设计、时间及地点:对比观察,于2007-06/2008-12在南方医科大学病理生理实验室完成.材料:由自愿者提供的正常和退变腰椎间盘组织各6例,年龄21～45岁,其中男9例,女3例;取材范围L3-L5.方法:氯化铯梯度离心去除正常和退变腰椎间盘组织蛋白多糖,通过崮相pH梯度(IPG)等电聚焦和梯度聚丙烯酰胺双向电泳分离蛋白质,分析电泳图像,使用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行分析鉴定.主要观察指标:正常腰椎间盘及退变腰椎间盘组织IPG等电聚焦双向凝胶电泳结果.结果:双向电泳显示正常和退变腰椎间盘蛋白质图谱差异显著,从中选取16个差异明显的位点进行质谱仪分析,确定了6种具有显著性意义的差异蛋白质.结论:双向电泳可有效地分离正常和退变腰椎问盘组织蛋白质,通过质谱仪鉴定可以确定其之间差异蛋白质的性质.     

大鼠急性肺栓塞血清差异表达蛋白的研究

目的研究急性肺栓塞（APE）大鼠血清和正常大鼠血清的差异蛋白表达变化。方法采用血栓颈静脉注入法制备大鼠APE模型,采用双向电泳技术找出差异蛋白,用MALDI-TOF技术和生物信息学技术鉴定差异蛋白,并对部分差异表达蛋白采用Western-blot技术作进一步验证。结果大鼠血清蛋白的2-DE胶银染可分离出1 400多个点,考染可达到1 200个点以上。经图像分析得到的24个差异表达蛋白中有12个蛋白得到鉴定。对部分差异蛋白采用Western-blot方法在蛋白水平的验证结果与2-DE结果基本相符。结论采用比较蛋白质组学的方法可以发现APE大鼠血清中的差异表达蛋白,这些差异表达蛋白分子将为我们寻找新的APE血清学标志物提供重要的线索和依据。     

肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的比较

目的 比较肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的表达变化情况,从中寻找特异性标志物.方法 用双向凝胶电泳分离正常人,慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清蛋白质,结合质谱技术对差异点进行鉴定; Western blot检测结合珠蛋白β链以验证蛋白质水平的表达.计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析和LSD检验进行两两比较.结果 4组血清的双向电泳图谱经软件匹配分析,并与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱相结合,成功鉴定出结合珠蛋白,SAA1、SP40等30个差异蛋白质点,K cluster聚类分析不同的变化模式.在差异蛋白质点中,7个蛋白质点均为结合珠蛋白,呈现由正常→肝炎→肝硬化持续下调、到肝癌又上调的模式.Western blot证实结合珠蛋白β链的表达与双向电泳表达相一致.结论 在肝癌发生的动态过程中各疾病阶段的血清蛋白质差异表达有4种明显变化模式,可能为肝癌的早期诊断和预后提供依据,与肝癌发生发展相关的结合珠蛋白很可能是肝硬化发展到肝癌的一个潜在早期诊断标志物.