一种新的双向电泳蛋白样品制备方法

目的探讨双向凝胶电泳（2-DE）样品裂解液对蛋白质分离和双向凝胶电泳结果的影响。方法以MOLT-4细胞为例，采用3种溶解性能不同的裂解液提取细胞中的蛋白质组，并分别进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果通过对2-DPAGE图谱的比较分析，发现采用8mol／L Urea，2mol／L Thiourea，4％CHAPS，1％NP-40.4％Triton X-100，65mmol／LDTT，0．5mmol／LPMSF，0．5％pharmalyte3-10，能获得质量较高的2-DE图谱。结论采用高浓度脲、三去污裂解液有利于获得优质的蛋白质样品，从而提高蛋白质提取率和双向电泳分辨率等。     

早期糖尿病肾病肾阳虚证的血浆蛋白质组学分析

目的寻找糖尿病肾病肾阳虚证敏感的血浆分子标志物。方法对4例早期糖尿病肾病肾阳虚证患者的血浆和4例正常人血浆进行荧光差异双向电泳（2－D DIGE）分析,选择表达差异大于1．5倍的蛋白斑点进行质谱分析。结果成功建立糖尿病肾病肾阳虚证血浆和正常血浆的胶内差异双向凝胶电泳图谱,通过分析共鉴定出9种差异蛋白质,包括补体C3、补体C4、载脂蛋白E、泛素化因子等。结论荧光差异双向电泳能够客观地显示糖尿病肾病肾阳虚证血浆与正常血浆之间的蛋白质表达差异,经鉴定的9种蛋白有可能为糖尿病肾病的早期诊断以及中医证型研究提供潜在的血浆分子标志物。     

肺腺癌和癌旁组织蛋白质表达谱差异的研究

通过比较肺癌患者癌组织和癌旁组织的二维凝胶电泳图谱(two-dimensional electrophoresis,2DE),以寻找肺癌相关蛋白、肺癌患者癌组织和癌旁组织,采用固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)2DE分离总蛋白质,凝胶经银染显后,ImageMaster 2D图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质并进行质谱鉴定获取肺癌相关蛋白信息。结果分析得到肺癌组织蛋白点709个,癌旁组织蛋白点722个,选择表达量差异达3倍以上的40个,进行胶内酶解,基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI TOF MS)获得肽质量指纹图谱(PMF),搜寻蛋白质数据库,得到7个肺癌标志物的候选蛋白,但这些差异蛋白点在肺癌发生发展中的作用需要进一步研究。     

两种不同溶液体系提取大鼠脊髓蛋白双向电泳图谱比较

目的：比较尿素／CHAPS和尿素／硫脲／CHAPS／SB3－10两种不同溶液体系提取大鼠脊髓蛋白双电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE)图谱的差异。方法：大鼠脊髓经三氯醋酸／丙酮沉淀粉蛋白后,分别用尿素／CHAPS和尿素／硫脲／CHAPS／SB3－10两种不同的溶液体系提取蛋白。以固相PH梯度（IPG）等电聚焦为第一向,SDS－PAGE水平电泳为第二向进行蛋白质2－DE。图像分析软件ImageMaster 2D Elite3.01分析蛋白质2－DE图谱。结果：两种蛋白提取溶液分别获得1059和1023个蛋白（亚基）斑点,其中790个蛋白在两张图谱中重叠,其余269和233个蛋白点为两种体系各自所特有。两种提取方法共获得1292个蛋白斑点。结论：综合使用不同蛋白提取方法有助于提高组织蛋白2－DE图谱的完整性。     

转醛醇酶在不同发育阶段小鼠睾丸中的表达及其亚型的分离和鉴定

目的：研究转醛醇酶在不同发育阶段小鼠睾丸中的表达并分离鉴定其亚型，方法：应用SDS－聚丙烯酰胺胶电泳（SDS－PAGE）、蛋白免疫印迹（Western bloting)对转醛醇酶在不同发育阶段小鼠睾丸中的表达进行半定量分析，同时利用双向电泳免疫印变技术分离，鉴定转醛醇酶的亚型。结果：（1）转醛醇酶在生后1周小鼠睾丸中表达量平均比成年高47．8％（P＜0．005）。（2）双向电泳Wester blotting示小鼠睾丸转醛醇酶共有10余个亚型，生后1周小鼠睾丸中a8亚型表达量极低，而在成年小鼠睾丸中a8亚型高表达。结论：（1）生后1周小鼠生长发育快，合成代谢旺盛，转醛醇酶基因绝对表达量高。（2）a8亚型可能与生殖功能（精子发生、睾酮生成）密切相关。     

免疫共沉淀结合双向电泳分离相互作用蛋白质的方法优化

目的：建立和优化有针对性的免疫共沉淀（CO-IP）与双向电泳（2DE）-质谱联合的技术来鉴定相互作用蛋白质。方法：利用特异性抗体通过CO-IP对细胞全蛋白中的目标蛋白进行富集,用不同洗脱液洗脱目标及其相互作用蛋白,并行2DE分离。结果：对CO-IP过程、洗脱液成分、上样量等关键步骤进行优化,得到满意的2DE图谱。结论：成功优化CO-IP与2DE分离技术,为通过蛋白质组学研究信号通路中重要蛋白质的相互作用提供有效方法。     

乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

[目的]利用蛋白质组学方法，识别乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞后差异表达的蛋白质，为进一步探讨乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。[方法]采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞的总蛋白质，用PDQuest7．3．1图像分析软件比较分析，以识别差异表达的蛋白质。[结果]空白对照组有268个斑点，Ethambutol（EMB）处理组有蛋白斑点195个，在相对分子质量和pI值分布的任一区域，EMB处理组蛋白斑点数均少于空白对照组，其中在EMB处理组中特异表达的蛋白质斑点有23个。[结论]乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc^2155细胞的蛋白质组具有差异，这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制并为寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。     

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究

目的 运用蛋白质组学的方法,比较正常人及早期活动性类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)蛋白质的差异表达,寻找RA疾病相关致病蛋白质.方法 选取9例早期活动期RA患者以及9名健康成年志愿者,用淋巴细胞分离液分离PBMCs,抽提PBMCs中的蛋白,采用同相pH梯度(IPG)双向凝胶电泳(2-DE)分离正常人及RA患者PBMCs总蛋白质.凝胶经考马斯亮蓝染色显色后,PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定,运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法验证部分差异蛋白质.结果 获得RA患者及正常人PBMCs蛋白质双向凝胶电泳图谱,平均蛋白质点数分别为556和579,匹配率分别为89.4%和 88.5%,通过比较分析,差异表达蛋白质点数为23,选取18个点进行质谱鉴定,成功鉴定14个蛋白质,其中a-肌动蛋白、纤维蛋白素原a-链、载脂蛋白A-I(ApoA-I)等9个蛋白质点在RA中表达上调,硫氧还蛋白-2、谷胱甘肽S-转移酶等6个蛋白质点在RA中表达下调,这些差异蛋白质的功能涉及物质代谢、抗氧化、信号传导、能量产生及细胞骨架.并用RT-PCR方法验证差异蛋白质ApoA-I.其结果与上述蛋白质差异表达结果相符.结论 在RA患者PBMCs中存在着差异表达蛋白质,这些差异蛋白质可能是RA发病的内在因素.其RT-PCR结果与蛋白质差异表达相符,证明蛋白质组研究的可靠性.     

大鼠脑组织蛋白质双向电泳技术的建立

目的：建立大鼠脑组织蛋白质双向电泳技术。方法：利用不同体积的裂解液提取大鼠脑组织中的蛋白质,并通过不同的蛋白质上样量（1mg,2mg,3mg）,进行双向电泳,考马斯亮蓝染色,图谱分析。结果：在等电点3～10,分子量6．5～200ku范围内分离得到蛋白质斑点为,1mg蛋白质上样量为546个蛋白质斑点,2mg为780个,3mg为805个斑点。2mg蛋白质上样量的双向电泳图谱更清晰,分离更好。结论：成功建立了大鼠脑组织蛋白质的双向电泳技术。     

黄芪对IgA肾病小鼠肾脏功能和肾组织蛋白质表达的作用

目的：研究右旋糖苷所致IgA肾病小鼠的肾组织蛋白表达变化和黄芪提取物（AEAR）对IgA肾病小鼠的作用。方法：给正常小鼠注射右旋糖苷建立IgA肾病小鼠模型。部分模型小鼠给予AEAR10g-kg^-1·d^-1。作为AEAR治疗组。为探究AEAR的作用,运用双向电泳（2-DE）技术分别获得正常对照组、IgA肾病模型组、AEAR组小鼠的肾组织蛋白凝胶,银染后,图像用PDQUEST双维分析软件分析比较,得到相应图谱。结果：连续12周给予AEAR的IgA肾病小鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）和尿蛋白含量明显降低,且它们的肾组织蛋白图谱相应恢复接近正常鼠的图谱形态。与正常组比较,模型组有334个蛋白表达有显著性差异,其中142个蛋白表达增强2倍,61个蛋白表达增强5倍,121个蛋白表达减弱2倍;10个蛋白在模型组特异表达,在正常组不表达。以上334个差异蛋白中的50％个蛋白在给予AEAR治疗后,表达水平趋近于正常对照组水平;上述10个特异表达的蛋白经过AEAR干预后,有5个蛋白恢复至正常的不表达状态,4个蛋白表达明显减弱接近正常水平,只有1个蛋白表达上调甚至高于模型组对应蛋白的表达水平,分析可能与IgA肾病发病或AEAR药物作用密切相关。结论：AEAR不仅具有保护IgA肾病小鼠肾脏功能的作用,而且能调节小鼠肾脏组织蛋白表达,有助于发现AEAR作用于IgA肾病的靶蛋白。