当归实时荧光定量PCR内参基因筛选

目的 通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)筛选当归Angelica sinensis不同材料中稳定表达的内参基因。方法 以不同生长期、春化温度、组织部位以及抽薹/未抽薹植株为材料,对转录组数据库获得的13个候选内参基因和1个已报道的肌动蛋白基因的表达水平进行qRT-PCR检测,利用ge Norm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder等软件分析表达水平的稳定性。结果 不同材料中14个候选内参基因的稳定性存在显著差异,ACT7、UBC32、UBC26和UBC7分别为不同发育阶段、春化温度、组织部位和抽薹/未抽薹植株中最稳定的内参基因;EEF1G为所有样品中最稳定的内参基因,其次为RPL3和UBC26。结论 为进一步检测当归产量和品质形成过程中的基因表达提供重要参考。     

HBV-HCV-HIV三联荧光PCR检测的内标浓度选择研究

目的 选择一个在乙型肝炎病毒-丙型肝炎病毒-人类免疫缺陷病毒（HBV—HCV—HIV）三联荧光PCR检测试验中既可有效监控假阴性结果出现，又对阳性结果影响最小的内标浓度。方法应用不同浓度的内标参入酶链聚合反应（PCR）反应，确定最佳内标参人量；并在适量内标浓度下，检测低浓度标本的阳性检出率。结果由内标浓度5拷贝／PCR、10拷贝／PCR、20拷贝／PCR、50拷贝／PCR、100拷／PCR5个浓度中，优选出最适的内标浓度为20拷贝／PCR，此条件下，阴性标本的内标检出率为100％，检测灵敏度标本的阳性检出率与无内标样本差异无统计学意义。结论合适浓度的内标参与荧光PCR检测能有效地解决了每个标本的质控问题，指示反应体系（试剂耗材）与检测体系（仪器）的有效性。     

穿心莲实时定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]选择合适的内参基因用于穿心莲实时定量PCR分析中的校正.[方法]以穿心莲根、茎、幼叶、花、萌发种子和成熟叶片为实验材料,应用实时定量PCR技术分析18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白(Actin)和泛素连接酶(UBC)4个常用内参基因在穿心莲不同组织中的表达水平,利用GeNorm和NormFinder软件进行数据分析.[结果]4个候选内参基因在穿心莲不同组织中表达的稳定性各异,其中UBC的表达水平最为稳定.[结论]可以选择UBC作为内参基因,用于穿心莲不同组织中基因表达水平的校正.     

内参照细胞在流式细胞术中应用的研究

目的研究内参照细胞对流式细胞术检测结果判定的价值。方法在同型对照与内参照条件下检测分析细胞表面与胞内抗原的表达结果,检测晶体格子场稳定能CFSE标记细胞荧光强度。结果采用正常淋巴细胞作为参照,能有效检测白血病细胞胞内的MPO抗原;CFSE标记人淋巴细胞时无法设立同型对照,在内参照的情况下能有效检测细胞的荧光强度;在淋巴细胞亚群测定时,检测结果在同型对照与内参照条件下存在差异。结论细胞表面抗原的检测需要严格的同型对照,但在胞内抗原检测与全细胞同荧光标记时可以使用内参照替代同型对照。     

不同饲料硒水平饲养大鼠的多组织内参基因筛选

目的筛选不同饲料硒(selenium,Se)水平饲喂大鼠时,不同组织中稳定表达的内参基因(reference genes,RGs)。方法 24只断乳雄性SD大鼠在缺Se饲养5周后,随机均分为4组,分别以Se含量0.01、0.25、3、5 mg/kg饲料饲喂4周后处死,取肝、睾丸、骨骼肌、脂肪组织等样品待检。以荧光定量PCR检测Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rplp2、Rps18、Tbp、Ywhaz等12个候选内参基因的mRNA水平,以geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT和RefFinder等方法对其表达稳定性进行评价。结果各组织中稳定性排名前4的内参基因是:肝中PpiaAtp5f1Rplp2Hprt;睾丸中YwhazAtp5f1Rplp2Ppia;骨骼肌中TbpPpiaB2mRps18;脂肪组织中HprtTbpAtp5f1Pgk1;综合4种组织,则Rps18HprtRplp2Atp5f1。结论分析不同饲料Se水平饲养大鼠的目标基因表达水平时,应根据组织类型选择适宜的内参基因。     

Ⅰ型糖尿病大鼠心肌内参基因的选择

目的探讨1型糖尿病大鼠心肌mRNA表达的内参基因选择。方法RT—PCR技术检测3个管家基因GAPDH、β—actin、RPLP0的表达水平。结果1型糖尿病大鼠心肌中表达想对稳定的管家基因是RPLP0。结论1型糖尿病大鼠心肌mRNA分析时需避免使用GAPDH、β—actin作为内参。     

阳春砂实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选稳定表达的内参基因,用于阳春砂不同发育时期的果皮和种子团中基因表达量实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测的校正。【方法】以阳春砂3个不同发育时期的果实(分为果皮和种子团)为材料,根据高通量测序得到的转录组和表达谱数据,选择5个表达稳定的常用内参基因β-actin、EF-1α、GAPDH、PGK和TUA作为候选基因,并利用qPCR技术检测它们在不同样品中表达水平的变化,使用GeNorm和NormFinder软件对基因的稳定性进行分析。【结果】5个内参基因在不同发育时期的果皮和种子团中的表达稳定性有明显的差异,其中GeNorm分析得到的内参基因的稳定顺序为:EF-1α=TUAPGKGAPDHβ-actin,NormFinder的分析结果中稳定性最好的是EF-1α,其次为TUA,其他3个内参基因稳定性的排列顺序与GeNorm软件的结果一致。【结论】可选用EF-1α和TUA作为阳春砂果实发育过程中基因表达量差异分析的双内参基因。     

罗汉果内参基因筛选和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶时空表达分析

目的筛选罗汉果Siraitia grosvenorii基因表达分析的内参基因,研究苷V生物合成关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)时空表达特性。方法克隆罗汉果看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、微管蛋白(α-tubulin)、肌动蛋白(β-actin)和泛素(UBQ5)的基因片段,评价了4个基因在不同部位(叶、茎和果)及果实发育不同时期的稳定性,筛选内参基因,分析HMGR的时空表达特性。结果 UBQ5表达最稳定,适宜作为内参基因;叶片的HMGR相对表达量较低,茎和果实相对表达量较高;果实不同发育时期,HMGR的相对表达量呈现先升高再降低然后再升高再降低的波动式变化,70 d后HMGR的相对表达量最高,然后依次是5、30、10、50 d。结论 UBQ5是适宜的内参基因。叶片、茎和果实中,HMGR的相对表达量差异明显。果实发育不同时期,HMGR的相对表达量呈波动式变化,与苷V合成积累变化规律相似。     

内参基因β-actin质粒标准品的构建

为构建检测内参基因β-actin mRNA表达水平差异的标准品,以成人外周血细胞的总RNA为模板、Random 6 mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA片段,构建PMD-18-β-actin重组质粒,鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果外周血提取的总RNA完整性良好,构建的β-actin质粒经PCR扩增后得到一186bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为2.39×1013 copies/mL,倍比稀释至2.0×104copies/mL均能得到良好的标准曲线(R2=1),提示构建β-actin基因荧光定量PCR标准质粒成功。     

大鼠原代脑微血管内皮细胞氧糖剥夺/复氧模型中内参基因的选择

目的筛选大鼠原代脑微血管内皮细胞氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型中合适的内参基因。方法实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测3种常用管家基因:3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)、核糖体蛋白L13A(RPL13A)在大鼠原代脑微血管内皮细胞中的表达水平;并采用Ge Norm程序分析得到最稳定的内参基因。结果 RPL13A、GAPDH、ACTB基因表达稳定度的平均值(M值)分别为0.590、0.570、0.397。结论在大鼠原代脑微血管内皮细胞OGD/R模型中表达最不稳定的内参基因是RPL13A,最稳定内参基因是ACTB。