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2.
中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达 总被引:2,自引:1,他引:1
从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中,通过脂质体介导转染COS-7细胞,用SDS-PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2-pcDNA3.1/His重组表达质粒,表达产物的相对分子量为56ku,与理论预期大小一致,并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2-pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有,能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性,重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。 相似文献
3.
4.
人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达 总被引:8,自引:1,他引:7
目的:克隆肿瘤特异性共享抗原mage-3基因,制备基于α-病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法:用RT-PCR方法从黑色素瘤细胞系LB373中制备mage-3基因,以含α-病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体,构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞,用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage-3蛋白的表达。结果:正确构建了mage-3/pSMART2a重组质粒,并且在转化此质粒的293细胞中检测出了mage-3蛋白的表达。结论:此重组mage-3/pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗,可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。 相似文献
5.
6.
间日疟原虫深圳株红内期SSUrDNA基因片段的克隆与序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 体外扩增间日疟原虫深圳株红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段,研究其结构与功能。方法 设计一对特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟原虫患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段,以PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109;阳性克隆双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列。结果 间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小为341bp;阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;序列测定插入片段为341bp,与Sal I株顺序相比,仅在第151位处缺失一个碱基C。结论 成功克隆了间日疟原虫SSUrDNA片段.该序列在间日疟原虫虫株间高度保守。 相似文献
7.
目的;克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因(the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex),构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段。方法:抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞,用RT-PCR、巢式-PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA,并克隆到pGEM-T Easy载体中,DNA测序鉴定,将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T,构建重组表达质粒pGEX/TRAILex,用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段,GST-Agarose 4B层析柱纯化GST-TRAILex融合蛋白,Western-blot鉴定纯化产物。结果:抗CD3 McAb能诱导正常人外周血核细胞TRAIL的高表达,成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因,构建了重组表达载体pGEX/TRAILex,IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段,经12%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量和理论值相符(约54kD)的诱导表达。Kodak软件分析表达GST-TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28%,进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达,用GST-Agarose 4B层析柱纯化超声破菌后的上清,每升细菌培养液可得到9.8mg纯度的95%以上的GST-Tex。Western-blot结果证实54kD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应。结论:成功地克隆了人TRAIL基因,并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段,为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。 相似文献
8.
李坤 《国外医药(植物药分册)》2005,20(6):242-245
基于PCR的抑制消减杂交(SSHPCR)是目前用于差异cDNA序列的检测,以及构建基因组差异DNA文库最有效、并且应用最广泛的方法之一。虽然这种方法有很多优点,但仍存在一定的局限性,具有一些不可避免的缺陷。从四个方面讨论SSH在植物功能基因研究中的应用,进而探讨SSHPCR方法在植物基因克隆方面遇到的问题及解决对策。 相似文献
9.
目的:克隆人KGF-2基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法:通过PCR扩增,从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2的cDNA,并将其分别克隆入pBV220,pLEX和pGEX4T-1质粒中,研究其在不同表达质粒和大肠杆菌中的表达情况。结果:克隆得到的KGF-2cDNA经测序证明与文献报道的序列一致。将其克隆于pBV220质粒中,在E.coli JM109中表达量相对最高,约占茵体总蛋白的4%;克隆于pLEX质粒中,在E.coli G1724中的表达量约占全茵总蛋白的5%;克隆于pGEX4T-1中,在E.coli JM109中的表达量可占到全茵总蛋白的20%。结论:采用GST融合蛋白表达质粒pGEX4T-1对KGF-2进行表达,较pBV220和pLEX具有明显优势,能实现对KGF-2的高效表达,为进一步的功能研究奠定了基础。 相似文献
10.
目的 克隆出视蛋白基因启动子。方法 以小鼠全基因组为模板,用PCR法克隆出目的大小的片断。然后连接到T-载体上作酶切鉴定,最后测序。结果 酶切结果与预期相符,测序结果与公布序列完全一致。结论 视蛋白基因启动子克隆成功。 相似文献