肠杆菌基因间重复序列PCR指纹图谱技术分析结核分枝杆菌流行情况

目的利用肠杆菌基因间重复序列为引物的聚合酶链反应（enterbacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR）分型技术分析我市结核分枝杆菌流行情况。方法收集2003年9月至2006年5月门诊痰菌阳性标本，培养并提取DNA做ERIC—PCR指纹图，并利用RAPDPHYLIP及Treeview软件对其进行聚类分析。结果122株临床分离株产生42种不同的指纹图，聚类分析结果显示可分为3簇，成簇率76、2％。指纹图谱与患者年龄、菌株的耐药性及耐药种类有关。结论ERIC—PCR具有不需已知核酸序列，分辨效果好，简便快捷等优点，是进行分子流行病学调查的有效工具。我市结核病呈高水平传播，主要为耐药菌株并以中青年患者传播为主。     

2017-2019年贵州省结核分枝杆菌多位点序列分析及与耐药的相关性

目的了解贵州省2017-2019年结核分枝杆菌分离株的等位基因型别特征及其与耐药的相关性,为贵州省结核病的防治提供科学依据。方法收集贵州省毕节市、安顺市、仁怀市和威宁县4个国家级结核病耐药监测点2017-2019年分离的52株结核分枝杆菌,采用基于7个管家基因位点(recX、rpsl、rmlC、rpmG1、mprA、gcvH、ideR)的MLSA技术进行ST分型。选用异烟肼(INH)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、利福平(RFP)、卡那霉素(KAM)和氧氟沙星(OFX)6种抗结核药物对52株结核分枝杆菌进行药敏试验,分析菌株耐药与ST型别的相关性。结果52株结核分枝杆菌经MLSA分为11个ST型,其中优势ST型为ST11型(占32.7%)、ST1(占23.1%)和ST5型(占15.4%)。药敏试验显示,52株结核分枝杆菌总耐药率为42.3%(22/52),其中单耐药率为15.4%(8/52),耐多药率为19.2%(10/52),多耐药率为3.8%(2/52)。基于7个管家基因位点的聚类分析和最小间距图分析结果显示,ST2、ST4和ST6型菌株全部为敏感菌株,ST7和ST8型菌株均为多耐药菌株,ST9型菌株均为耐多药菌株,其余ST型由耐药和敏感菌株构成。结论贵州省2017-2019年结核分枝杆菌以ST11、ST1和ST5型为主,ST型呈现多样性。菌株以单耐药和耐多药为主,ST型与耐药具有一定的相关性。     

结核分枝杆菌临床分离株药敏结果与耐药程度的关联分析

目的 探讨结核分枝杆菌临床分离株对12种抗结核药物的MIC值及其药敏检测结果 与耐药程度的关联规律,从而为临床制定治疗方案提供借鉴依据.方法 采用液体培养基联合MTT技术进行抗结核药物的MIC检测.对上海市肺科医院2009年1-6月间的163株结核分枝杆菌临床分离株进行RFP、INH、SM、EMB、OFLX、LVFX、MOX、AMK、CPM、PTA、CLA和PAIN的MIC检测和Bactec MGIT快速培养仪药敏检测,并进行MIC与耐药程度的关联性分析.结果 67%(42/62)的SM耐药株MIC≥16 μg/ml,63%(51/81)的INH耐药株MIC≥8 μg/ml,77%(50/65)的RFP耐药株MIC≥8 μg/ml,20%(12/60)的EMB耐药株MIC≥4 μg/ml;43%(25/58)的OFLX耐药株MIC≥8 μg/ml;41%(15/37)的AMK耐药菌株MIC≥16 μg/ml,41%(12/29)的CPM耐药菌株MIC≥4 μg/ml.OFLX耐药株的3个氟喹诺酮类药物的MIC(OFLX、LVFX和MOX的MIC分别为2～128、1～32和0.0625～1 μg/ml)差异有统计学意义(F=16.874,P<0.01);SM、INH、RFP、EMB、OFLX、AMK和CPM在任6种及7种药物同时耐药株中的MIC值(分别为0.5～128、2～64、0.25～128、1～32、1～64、0.5～128和1～128μg/ml)明显高于任1种及2种药物耐药菌株的MIC值(MIC值分别为0.25～128、0.0625～64、0.25～32、0.25～2、0.125～2、0.5～4和1～4 μg/ml,F值分别为20.066、40.499、47.197、70.373、91.432、41.840和21.547,P均<0.05);SM、INH、RFP、EMB在4种药物同时耐药菌株中MIC值(分别为1～128、2～64、0.25～128和1～32μg/ml)显著高于任1种及2种药物耐药株(MIC值分别为0.25～128、0.0625～64、0.25～64和0.25～2 μg/ml,F值分别为26.242、23.563、31.541和64.469,P均<0.05);RFP在MDR酶株的MIC值(2～64 μg/ml)显著高于非MDR的耐药菌株的MIC值(0.25 μg/ml,F=5.613,P<0.05).结论 本研究揭示了常用的12种抗结核药物的耐药程度与常规药敏检测结果 之间的关联规律,为临床医生根据常规药敏结果 制定更加有效的抗结核治疗方案提供重要的借鉴.     

基因芯片技术在结核分支杆菌耐药突变基因检测中的应用

目的通过基因芯片检测系统，快速检测临床样品中结核分支杆菌耐药突变情况。方法根据结核分支杆菌标准株H37Rv序列，设计了覆盖rpoB、katG，inhA基因突变区的系列寡核苷酸探针，制作膜芯片，检测临床样品中结核分支杆菌基因突变情况，以此判断耐药结果。结果在305例临床病例中，共检出阳性病例125例，其中阳性敏感病例64例，阳性突变病例61例，阳性率为40．98％，在125例阳性样品中，共发现有8种突变类型，其中10例531L，占7．94％，19例315M，占阳性样品中总数的15．08％。结论PCR与膜芯片杂交技术可临床检测结核分支杆菌对利福平和异烟肼的耐药性，并具有快速、简便、敏感的特点。     

噬菌体快速检测结核分支杆菌方法的改良研究

目的改良噬菌体裂解法检测结核分支杆菌试验的步骤,提高该试验的阳性率和敏感性。方法通过采用2％～5％不同浓度NaOH和0～24h不同时长的孵育时间等对结核患者痰液标本和结核菌株进行对比试验,分析不同试验条件对结果的影响,总结该方法的最佳试验条件。结果单因素分析结果显示,3％NaOH用于痰液标本的消化处理可以在杀灭痰液标本中的杂菌的同时更好地保持结核分支杆菌的活力。消化后的标本是否用磷酸盐缓冲液清洗及是否进行24h孵育对结果中的噬菌斑数量无显著影响。同时对临床标本的检测结果表明,未经过夜孵育标本污染率小于过夜孵育标本。结论采用3％NaOH消化处理痰液标本后不进行缓冲液清洗和24h孵育步骤,直接用噬菌体感染标本中的结核分支杆菌较原方法能更好地保存了结核分支杆菌活力,避免了杂菌过度的繁殖,提高了噬菌体裂解法快速检测结核分支杆菌试验（FASTTPlaque TB^TM）检测结果的阳性率和敏感性,同时简化了试验步骤,缩短了试验时间。     

耐多药结核分枝杆菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性研究

目的 研究耐多药结核分枝菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性. 方法 比例法检测84株耐多药结核分枝杆菌的乙胺丁醇(EMB)耐药性,基因测序检测embB基因的突变,2检验分析二者之间的相关性. 结果 84株耐多药结核分枝杆菌中有43株(51.2%)对EMB耐药,41株(48.8%)对EMB敏感,57株耐多药菌株(67.9%)的embB基因发生突变.在43株EMB耐药菌株中,embB基因突变的菌株为40株(93.0%),而41株EMB敏感菌株中,embB基因突变的菌株为17株(41.5%),embB基因在耐药菌株中的突变频率远高于敏感菌株(2=25.58,P=0.00).embB306是最常见的突变位点,其在耐药菌株的突变率也高于敏感菌株(2=12.37,P=0.00),embB基因和embB306位点检测EMB耐药的敏感度、特异度和准确性分别为93.0%和65.1%,58.5%和73.2%,76.2%和69.0%. 结论 EMB耐药的产生与embB基因和embB306突变有关,二者用于检测EMB耐药有一定的参考意义.     

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用

目的　获得重组MPT64蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET15b MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外,其余密码子均与报道的相同,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的20～30%,分子量约26kDa,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80%左右,每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 +2S为正常界限值,PDD的特异性和敏感性分别为94% (31/33)、63.7% (21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94% (31/33)、30.3(10/33);一步法分别为88% (29/33)、66.7% (22/23)。结论 pET15b MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

母牛分支杆菌菌苗在初治肺结核治疗中的作用

目的 观察和评价母牛分支杆菌菌苗（微卡菌苗）在初治肺结核免疫治疗中的疗效及安全性。方法 采用随机配对分组法将342例初治菌阳肺结核患者分入微卡菌苗治疗组（M组,171例）和对照组（C组,171例）。M组化疗方案为2HRZE／2HR,C组为2HRZE／4HR。M组加用微卡菌苗治疗6个月,C组不用微卡菌苗。结果 M组第1个月涂片阴转率36．8％,培养转率19．3％;第2个月涂片阴转率80．1％,培养阴转率85．9％。C组第1个月涂片阴转率19．9％,培养阴转率19．3％;第2个月涂片阴转率54．4％,培养阴转率67．8％。头2个月痰菌阴转率M组显著高于C组（P＜0．01）。疗程满6个月后M组涂片阴转率98．2％,培养阴转率99．4％;C组涂片阴转率98．8％,培养阴转率98．8％。M组与C组治疗6个月痰菌阴转率无显著性差异（P＞0．05）。病灶吸收好转及空洞缩小关闭速度,M组优于C组。M组的细胞免疫功能显著改善。1年后随访M组和C组的的细菌学复发率分别是3．0％和5．6％（P＞0．05）。结论 微卡菌苗能改善初治肺结核患者的细胞免疫功能,加快痰菌阴转、病灶吸收及空洞缩小关闭的速度,缩短短程化疗疗程。不良反应少且较轻微。复发率底。微卡菌苗可用作初治肺结核的免疫治疗和短化的辅助治疗。     

不同年龄组结核分支杆菌耐药性的研究

目的 了解近阶段不同年龄组结核分支杆菌耐药情况,探讨当前耐药发展趋势。方法 根据年龄将1948例肺结核患者分为青年组（18－39岁）,中年组（40－59岁）和老年组（≥60岁）;采用绝对浓度法进行抗结核药物耐药性测定。结果 青年组、中年组、老年组原发耐药率分别为36．1％、46．8％和40．2％,各组间差异无显著性（P＞0．05）。青年组、中年组、老年组获得性而药率分另为81．3％、70．1％和62．1％,青年组和老年组差异有显著性（P＝0．0916）。原发耐药频度各年龄组从高到低均依次为H、E、S、P,中年组耐R最高达10．6％。获得性耐药顺序青、中年组为H、R、S、E,老年组为H、S、R、E,其中青年组耐R率最高达63．3％。原发耐多药率以中年组最高为5．3％,显著高于青年组（P＝0．0112）和老年组（P＝0．0085）。获得性耐多药率青年组最高达55．2％,显著高于中年组（P＝0．0319）和老年组（P＜0．001）。既往用1－3个月者耐药58．7％,显著高于未用药者（P＜0．001）和用药＜1月者（P＝0．0472）,而未用药和有药＜1月者耐药率差异无显著性（P＝0．02929）。此外,在各年龄组中青年组发生耐药的速度最快。结论 不同年龄组无论原发耐药还是获得性耐药均有所不同,建议应重视不同年龄组耐药率的监测,为修订国家结核病规划提供依据。