兔抗人DR5抗血清诱导Jurkat细胞凋亡

制备兔抗人sDR5抗血清,检测它对Jurkat细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。采用本室制备的sDR5免疫新西兰白兔,制备兔抗人sDR5抗血清,用ELISA法测定抗sDR5抗血清效价及抗血清的特异性。MTT试验分析它对Jurkat细胞生长抑制影响,倒置光显微镜和荧光显微镜观察抗sDR5抗血清对Jurkat细胞形态的影响,用AnnexinV/PI双染试剂盒检测Jurkat细胞凋亡率,琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞中DNA的片断化。结果:获得了高效价特异性兔抗人sDR5抗血清。兔抗人sDR5抗血清对Jurkat细胞具有显著的细胞生长抑制作用,并呈剂量依赖性。兔抗人sDR5抗血清处理后,Jurkat细胞可出现典型的细胞凋亡的形态特征:细胞膜皱缩,出泡,染色质浓缩,形成凋亡小体等。流式细胞术结果显示:兔抗人sDR5血清1/80、1/160作用Jurkat细胞2 h,细胞凋亡率分别为54.98%和34.13%。兔抗人sDR5抗血清可导致Jurkat细胞中的DNA片段化。本室制备的兔抗人sDR5抗血清能抑制Jurkat细胞生长和诱导Jurkat细胞凋亡。     

26S蛋白酶抑制剂b-AP15对Jurkat及RS4;11细胞增殖、凋亡的影响及凋亡机制的研究

目的 探讨26S蛋白酶抑制剂b-AP15对Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖及细胞凋亡的影响,并分析其作用机制.方法 无菌条件下对Jurkat细胞与RS4;11细胞进行培养,根据有无b-AP15处理,将其分为4组:①Jurkat细胞实验组;②Jurkat细胞对照组;③RS4;11细胞实验组;④RS4;11细胞对照组.其中,Jurkat细胞实验组与RS4;11细胞实验组采用浓度分别为0.05,0.10,0.50,1.00,5.00 μmol/L b-AP15处理24,48 h;Jurkat细胞对照组与RS4;11细胞对照组采用RPMI 1640培养基进行同步培养.采用CCK-8法绘制4组细胞增殖曲线;采用Annexin Ⅴ-别藻蓝蛋白(APC)/7-氨基放线菌素D(7-AAD)双标记流式细胞术检查4组细胞凋亡情况;采用流式细胞术检测细胞4组细胞周期分布情况;采用实时定量PCR检测4组细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2相关Ⅹ蛋白(Bax)基因、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2基因、Ⅹ连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、周期素依赖性激酶(CDK)1基因及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3基因mRNA表达水平.结果 ①b-AP15对Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖均具有抑制作用,且该抑制效应呈时间与剂量依赖性;Jurkat细胞经b-AP15处理24,48 h后,半数抑制浓度(IC50)分别为(1.52±0.35)μmol/L与(0.54±0.01) μmol/L,RS4;11细胞经b-AP15处理24,48 h后IC50分别为(0.97±0.02)μmol/L与(0.08±0.03)μmol/L.②使用浓度为1.5 μmol/L b-AP15处理Jurkat细胞实验组后,其与Jurkat细胞对照组相比细胞凋亡率显著增高,且差异有统计学意义(P＜0.001);使用浓度为1.0 μmol/Lb AP15处理RS4;11细胞实验组后,其与RS4;11细胞对照组相比细胞凋亡率亦显著增加,且差异亦有统计学意义(P＜0.001);且Jurkat细胞与RS4;11细胞经b-AP15处理48 h后,与处理24 h后者相比细胞凋亡率增高,且差异均有统计学意义(t=11.887,7.449;P＜0.001).③与Jurkat细胞对照组相比,使用浓度为1.5 μmol/L b-AP15处理Jurkat细胞实验组24 h后,Jurkat细胞周期明显被阻滞于G2/M期,且差异有统计学意义(t=10.672,P＜0.05);同时伴S期细胞比例减低,且差异亦有统计学意义(t=19.053,P＜0.05).与RS4;11细胞对照组相比,使用浓度为1.0 μmol/L b-AP15处理RS4;11细胞实验组24 h后,RS4;11细胞周期亦明显被阻滞于G2/M期,且差异有统计学意义(t=13.643,P＜0.05);同时伴S期细胞比例减低,且差异亦有统计学意义(t=6.992,P＜0.05).④使用b-AP15处理Jurkat细胞与RS4;11细胞24 h后,荧光定量PCR检测结果显示,凋亡相关基因Bax、caspase-3 mRNA相对表达水平增高,Bcl-2、XIAP mRNA相对表达水平减低,同时伴细胞周期相关基因CDK1 mRNA相对表达水平减低,与各自细胞对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05);且RS4;11细胞实验组caspase-3 mRNA相对表达水平较Jurkat细胞实验组相比,增高程度更为显著,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 b-AP15能有效抑制Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖,并促进其细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G2/M期,其促凋亡机制与上调Bax与caspase-3基因表达水平、下调Bcl-2与XIAP基因表达水平相关,细胞周期G2/M期阻滞与CDK1基因表达水平减低相关.     

超顺磁性氧化铁纳米粒子增强Jurkat T细胞的活力和增殖能力

目的观察超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPION)对T淋巴细胞型白血病细胞株Jurkat E6-1细胞增殖和活力的影响。方法常规培养Jurkat E6-1细胞,将一定浓度的SPION加入经CFSE负载的Jurkat细胞中不同时间,然后用PBS将细胞外的SPION洗去,再换用完全培养基培养一定时间,最后采用流式细胞术定量检测Jurkat细胞的增殖情况,用CCK-8细胞活力测定试剂盒检测Jurkat细胞的活力。结果 SPION(20μg/ml)促进Jurkat细胞增殖,使已分裂细胞百分比增高(与对照值相比,P<0.05),分裂指数增高(与对照组相比,P<0.05);SPION也使Jurkat细胞的活力显著增强(与对照组相比,P<0.01)。此外,SPION对Jurkat细胞有钙动员作用,可使Jurkat细胞的胞内游离钙水平显著增高。结论 SPION能促进Jurkat细胞增殖,并增强其活力;这些效应与其钙动员作用有关。     

Recombinant carcinoembryonic antigen as a reporter gene for molecular imaging

Purpose  Reporter genes can provide a way of noninvasively assessing gene activity in vivo. However, current reporter gene strategies may be limited by the immunogenicity of foreign reporter proteins, endogenous expression, or unwanted biological activity. We have developed a reporter gene based on carcinoembryonic antigen (CEA), a human protein with limited normal tissue expression. Methods  To construct a CEA reporter gene for PET, a CEA minigene (N-A3) was fused to the extracellular and transmembrane domains of the human FcγRIIb receptor. The NA3-FcγRIIb recombinant gene, driven by a CMV promoter, was transfected in Jurkat (human T cell leukemia) cells. Expression was analyzed by flow cytometry, immunohistochemistry (IHC), and microPET imaging. Results  Flow cytometry identified Jurkat clones stably expressing NA3-FcγRIIb at low, medium, and high levels. High and medium NA3-FcγRIIb expression could also be detected by Western blot. Reporter gene positive and negative Jurkat cells were used to establish xenografts in athymic mice. IHC showed staining of the tumor with high reporter gene expression; medium and low N-A3 expression was not detected. MicroPET imaging, using an anti-CEA ¹²⁴I-labeled single-chain Fv-Fc antibody fragment, demonstrated that only high N-A3 expression could be detected. Specific accumulation of activity was visualized at the N-A3 positive tumor as early as 4 h. MicroPET image quantitation showed tumor activity of 1.8 ± 0.2, 15.2 ± 1.3, and 4.6 ± 1.2 percent injected dose per gram (%ID/g) at 4, 20, and 48 h, respectively. Biodistribution at 48 h demonstrated tumor uptake of 4.8 ± 0.8%ID/g. Conclusion  The CEA N-A3 minigene has the potential to be used as a reporter gene for imaging cells in vivo.     

雷帕霉素协同去甲氧柔红霉素诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株凋亡的作用

目的:探讨去甲氧柔红霉素( idarubicin,IDA)联合雷帕霉素(rapamycin,Rapa)抗人急性T淋巴细胞白血病(T-ALL) Jurkat细胞株的效应及机制.方法:应用CCK-8法分析两药联用对细胞增殖的影响;Isobologram法分析两药联合作用的性质;电镜形态学观察和Annexin V/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况;免疫印迹法检测凋亡相关基因Caspase3、PARP、Caspase8、Caspase9及Akt、p-Akt、P85S6K、p-P85S6K、P70S6K、p-P7OS6K、ERK1/2、p-ERK1/2等蛋白质水平表达.结果:CCK-8法示IDA联合Rapa能明显降低IDA的半数抑制浓度(50% inhibition concentration,IC50)值.Isobologram法示两药联合指数小于1.免疫印迹法示两药联用组较IDA单用组更能激活Caspase3和底物PARP,Caspase8和Caspase9在两药联用组均呈现明显激活.IDA联用Rapa后能使mTOR 信号通路上游的Akt及下游的P85S6K、P70S6K分子磷酸化水平明显降低,并能协同下调ERK的磷酸化水平.结论:Rapa和IDA对Jurkat细胞的生长抑制具有协同作用,两药联用时细胞凋亡增加,且通过线粒体和细胞膜双途径增强凋亡效应.其协同机制可能与Rapa逆转IDA引起的Akt/mTOR信号通路激活,并抑制ERK信号活化有关.     

Aiolos基因过表达对白血病细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的 研究Aiolos基因过表达对白血病细胞周期、凋亡及化疗敏感性的影响并探讨其机制。方法 将Jurkat细胞分为Aiolos过表达组、转染GFP组和未转染组,构建Aiolos基因慢病毒载体,感染Jurkat细胞并检测3组细胞的细胞周期、凋亡、相关基因表达及对依托泊苷敏感性。结果 Aiolos转染Jurkat细胞4d后,Aiolos过表达组和转染GFP组的GFP表达量达80%以上,且Aiolos过表达组的Aiolos蛋白表达较转染GFP组和未转染组明显上升(P<0.05)。Aiolos过表达组细胞凋亡比例较转染GFP组和未转染组明显增加(P<0.05),细胞周期由G0/G1进入S期比例明显减少(P<0.05)。周期相关基因Cyclin D3和Skp2表达下调(P<0.05),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21和P27表达上调(P<0.05);凋亡相关基因Bax表达无明显变化,Bcl-2表达下调(P<0.05),Bax/Bcl-2比例增加(P<0.05)。Aiolos过表达组细胞在依托泊苷浓度40μg/mL作用36、48h后,细胞存活百分率较转染GFP组和未转染组均明显降低(P<0.05)。结论 在Jurkat细胞系中介导Aiolos基因过表达能够促进细胞凋亡、抑制细胞周期并提高细胞对化疗药物的敏感性。     

针对c-myc基因的小干扰RNA对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的c-myc、h-tert表达的影响

本研究探讨针对c-myc的小干扰RNA对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞c-myc,h-tert基因和蛋白表达的影响,为白血病的基因治疗提供新方法和靶点。针对c-myc mRNA的第1545-1565靶位点用化学合成法合成siRNA,经转染剂转染入Jurkat细胞。应用RT-PCR及Western blot分别检测c-myc siRNA作用前后c-myc、h-tert基因的mRNA及蛋白表达的变化。结果表明:c-myc siRNA能明显抑制Jurkat细胞的增殖,作用48小时的半数抑制浓度(IC50)约为75nmol/L。c-myc siRNA可引起Jurkat细胞的c-myc、h-tert mRNA和C-MYC、hTERT蛋白表达水平降低。结论:c-myc siRNA明显降低Jurkat细胞c-myc、h-tert基因的mRNA及蛋白表达水平。c-myc siRNA可能是通过抑制c-myc mRNA表达而降低胞内C-MYC蛋白水平。     

几种子同方式诱导Jurkat细胞凋亡过程中TFAR19的表达

为探讨一个新的细胞凋亡相关基因－ＴＦＡＲ１９所参与的凋亡途径,我们研究了几种不同方式诱导白血病细胞株Ｊｕｒｋａｔ细胞凋亡过程中ＴＦＡＲ１９表达的变化。采用去除血清,ＶＰ－１６作用及Ｆａｓ单抗活化受体等方法诱导Ｊｕｒｋａｔ细胞凋亡后,以ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｍＲＮＡ水平ＴＦＡＲ１９的表达,用流式细胞术及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测蛋白水平ＴＦＡＲ１９的表达。实验结果显示,Ｊｕｒｋａｔ细胞在去除血清１２小时,     

mDRA-6诱导Jurkat细胞凋亡的外源性机制

目的:探讨抗人死亡受体5(DR5)单克隆功能抗体(mDRA-6)对人白血病Jurkat细胞诱导凋亡的外源性机制。方法:用显微镜观察mDRA-6作用后的Jurkat细胞形态学变化,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析技术对Jurkat细胞的凋亡进行定量分析;利用免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase 10、Caspase 9、Caspase8、Caspase 7、Caspase 3等凋亡相关蛋白的表达及活化情况。结果:mDRA-6在5 mg/L浓度作用Jurkat细胞30min时就出现典型的细胞凋亡形态改变,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测显示,Jurkat细胞在30 min、60min1、20 min的凋亡率分别为30.20%、69.03%、79.55%。免疫印迹技术检测显示Caspase 9、Caspase 8、Caspase7、Caspase 3均呈现活化片断的表达,而Caspase 10无变化。结论:mDRA-6可通过细胞膜表面死亡受体信号传导途径诱导Jurkat细胞的凋亡,本研究为mDRA-6的人源化改造及后续的实验研究打下了基础。     

Zebularine对Jurkat、K562细胞p53基因表达的影响

目的了解药物zebularine对白血病细胞株Jurkat、K562细胞p53基因表达的影响,探讨其作用机制及在白血病基因治疗中的价值。方法根据zebularine作用终浓度将白血病细胞株Jurkat、K562各分为3组:对照组、250μmol/L组、500μmol/L组,分别用RT-PCR、Western-blot方法检测Jurkat、K562细胞在药物干预48 h后p53 mRNA和蛋白的表达情况。根据检测结果,探讨其作用机制及应用价值。结果在zebularine干预48 h后,在对照组和250μmol/L组均检测不到p53mRNA表达,而在500μmol/L组中检测到有p53mRNA表达,差异有显著性(P<0.05);6组细胞样品中均检测到p53蛋白表达,在500μmol/L组中表达上升,差异有显著性(P<0.05)。结论Zebularine可促进Jurkat、K562白血病细胞株p53的表达,并有一定的浓度依赖性,提示zebula-rine的干预激活了p53的表达,为zebularine治疗白血病提供了实验室依据。