Exposure of Jurkat cells to bis (tri-n-butyltin) oxide (TBTO) induces transcriptomics changes indicative for ER- and oxidative stress, T cell activation and apoptosis

Tributyltin oxide (TBTO) is an organotin compound that is widely used as a biocide in agriculture and as an antifouling agent in paints. TBTO is toxic for many cell types, particularly immune cells. The present study aimed to identify the effects of TBTO on the human T lymphocyte cell line Jurkat. Cells were treated with 0.2 and 0.5 μM TBTO for 3, 6, 12 and 24 h and then subjected to whole genome gene expression microarray analysis. The biological interpretation of the gene expression profiles revealed that endoplasmic reticulum (ER) stress is among the earliest effects of TBTO. Simultaneously or shortly thereafter, oxidative stress, activation of NFKB and NFAT, T cell activation, and apoptosis are induced. The effects of TBTO on genes involved in ER stress, NFAT pathway, T cell activation and apoptosis were confirmed by qRT-PCR. Activation and nuclear translocation of NFATC1 and the oxidative stress response proteins NRF2 and KEAP1 were confirmed by immunocytology. Taking advantage of previously published microarray data, we demonstrated that the induction of ER stress, oxidative stress, T cell activation and apoptosis by TBTO is not unique for Jurkat cells but does also occur in mouse thymocytes both ex vivo and in vivo and rat thymocytes ex vivo. We propose that the induction of ER stress leading to a T cell activation response is a major factor in the higher sensitivity of immune cells above other types of cells for TBTO.     

蝎素组分Ⅲ对Jurkat细胞人白细胞分化抗原25表达的影响

目的研究蝎素组分Ⅲ(SVC-Ⅲ)对Jurkat细胞人白细胞分化抗原25(CD25)表达的影响。方法用0.1μg.L-1、1μg.L-1和10μg.L-1的SVC-Ⅲ分别作用CD4+T淋巴细胞系Jurkat E6-1细胞,利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测T细胞活化连接蛋白(LAT)和zeta链相关蛋白-70(ZAP-70)mRNA的表达;利用流式细胞术检测T淋巴细胞活化早期表面标志细胞分化抗原CD25分子表达变化情况。结果与对照组比较,0.1μg.L-1组和1μg.L-1组LAT/GAPDH比值增高(P<0.05),10μg.L-1组LAT/GAPDH比值增高,但差异无统计学意义(P>0.05),3组ZAP-70/GAPDH比值及CD25阳性细胞率均增高(P<0.05);与0.1μg.L-1组比较,1μg.L-1组LAT/GAPDH、ZAP-70/GAPDH比值和CD25阳性细胞率均增高(P<0.05),10μg.L-1组LAT/GAPDH,ZAP-70/GAPDH比值和CD25阳性细胞率均降低(P<0.05),且10μg.L-1组LAT/GAPDH、ZAP-70/GAPDH比值和CD25阳性细胞率较1μg.L-1组也降低(P<0.05)。结论SVC-Ⅲ对Jurkat细胞CD25的表达具有明显的促进作用,其中1μg.L-1SVC-Ⅲ浓度促进作用最强,为蝎素在临床上的合理应用提供一定的实验基础。     

HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建

目的:构建不同长度的高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因调控序列的真核表达载体及其稳定表达的Jurkat细胞株,为研究HMGB1基因在白血病发病机制建立基础。方法:以Jurkat细胞基因组为模板,PCR扩增3’端固定的8个不同长度的HMGB1调控基因(-83 bp～+83 bp、-383 bp～+83 bp、-504 bp～+83 bp、-688 bp～+83 bp、-975 bp～+83 bp、-1 163 bp～+83 bp、-1 327 bp～+83 bp、-1 520 bp～+83 bp),均将其连入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌DH5a。对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序获得序列正确的阳性克隆,然后再经酶切连入pGL3-neo-luc质粒,成功构建HMGB1基因调控序列报告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至长顺序依次命名为1～8号质粒)。利用脂质体介导的方法将不同长度的pGL3-HMGB1-luc质粒和pGL3-neo-luc质粒分别转染至Jurkat细胞,48小时后加入终浓度600μg/ml的G418进行药物加压筛选,20天后得到有效转染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc载体的Jurkat细胞株(按有无HMGB1调控基因及其由短至长顺序,依次命名为NEO细胞和1～8号细胞)。通过检测荧光素酶活性,验证构建的Jurkat稳定细胞株(Jurkat-HMGB1)。结果:HMGB1调控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间构建出3号质粒;HMGB1调控序列1016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp长度的HMGB1调控基因定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,分别构建出1号、2号、4号、5号、6号、7号质粒。8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示条带与扩增的HMGB1调控序列长度一致。HMGB1-T载体的DNA测序结果与NCBI提供序列完全匹配。成功构建了不同长度的3’端固定的pGL3-HMGB1-luc报告基因。pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc稳定转染至Jurkat细胞后,成功构建了NEO细胞和稳定细胞株HJ1～8,其荧光素酶发光值分别为:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490。结论:构建的HMGB1调控序列报告基因和HJ稳定细胞株为找寻有意义的HMGB1调控区域,以及后期研究HMGB1基因在成人T淋巴细胞白血病中的发病机制奠定了基础。     

利用亲和层析法检测乙酰化蛋白的研究

目的 建立一种快速、相对定量检测乙酰化蛋白方法,并初步应用其检测药物作用后Jurkat细胞乙酰化总蛋白水平.方法 用不同浓度的曲古菌素A(TSA)诱导Jurkat细胞蛋白高乙酰化后,利用抗乙酰化赖氨酸抗体亲和层析柱富集纯化乙酰化总蛋白,经酸洗脱后固定于酶标板,ELISA法检测乙酰化蛋白相对总量,并用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)分析验证其成分;同法检测不同浓度的没食子酸、大黄素、单乙酰化大黄素A三种药物作用Jurkat细胞后乙酰化总蛋白水平的变化,筛查诱导Jurkat细胞蛋白乙酰化药物.结果 1μmol/L TSA作用于4×105Jurkat细胞24 h,乙酰化总蛋白相对水平最高.MALDI-TOF/TOF分析显示,TSA诱导Jurkat细胞产生的乙酰化蛋白共有22种,其中15种为乙酰化组蛋白.没食子酸、大黄素、单乙酰化大黄素A作用Jurkat细胞后所导致的乙酰化程度不同,以1μmol/L浓度TSA为阳性对照组,无药物为空白对照组,35.09 μmol/L和17.54 μmol/L大黄素处理的Jurkat细胞乙酰化蛋白相对水平分别为4.3％和14.2％;1.47 μmol/L和2.94 μmol/L没食子酸处理组乙酰化蛋白相对水平分别为28.7％和11.5％;152.91 μmol/L和30.58 μmoL/L单乙酰化大黄素组分别为22.0％和3.6％;其中1.47 μmol/L没食子酸所诱导的乙酰化蛋白水平最高.结论 初步建立了活细胞基础上纯化富集并检测乙酰化总蛋白水平的方法,该法可快速、简便的筛选以组蛋白去乙酰化酶为靶点的抗癌药物.     

PI3K／Akt／mTOR在表阿霉素抑制Jurkat细胞增殖和诱导凋亡中的作用

目的 探讨PI3K／Akt／mTOR信号通路在表阿霉素抑制人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat细胞增殖和诱导凋亡中的作用。方法 用0、1.25、2.5、5、10μmol／L表阿霉素和0、0.25、0.5、1、2μmol／L PI3K／mTOR双重抑制剂（NVP-BEZ235）对Jurkat细胞作用48h后,CCK-8试剂盒检测Jurkat细胞株增殖抑制情况;采用AnnexinⅤ／PE双染法流式细胞术检测上述药物作用Jurkat细胞48h的凋亡率以及5μmol／L表阿霉素和2μmol／L NVP BEZ235单独及联合作用Jurkat细胞0、12、24、36、48h的凋亡率;Western blotting法检测5、10μmol/L的表阿霉素作用Jurkat细胞0、6、12、24、48h,以及5μmol/L表阿霉素与2μmol/L NVP BEZ235单独及联合作用Jurkat细胞24、48h的PI3K／Akt／mTOR信号通路中Akt、mTOR、p70s6k等表达变化。结果 表阿霉素能够抑制Jurkat细胞增殖并诱导其凋亡,且凋亡作用呈浓度依赖性,5μmol／L表阿霉素作用Jurkat细胞48h的凋亡率为57.72％。在表阿霉素诱导Jurkat细胞凋亡过程中伴随Akt、mTOR、p70s6k的表达变化, NVP-BEZ235能够降低Jurkat细胞Akt、p70s6k的磷酸化水平,显著提高表阿霉素诱导Jurkat细胞凋亡的作用,5μmol／L表阿霉素和2μmol／L NVP-BEZ235联合作用Jurkat细胞48h的凋亡率达78.31％,明显高于5μmol／L表阿霉素的57.72％。结论 表阿霉素抑制Jurkat细胞增殖和诱导凋亡与PI3K／Akt／mTOR信号通路有关,当该通路抑制剂与表阿霉素联用时,Jurkat细胞对于表阿霉素敏感性有一定程度的提高。     

华蟾素对Jurkat细胞株的体外作用和动物实验研究

目的:通过体外实验和动物实验,探索华蟾素对白血病细胞株的作用。方法:通过四氮唑蓝(MTT)比色法、Hoechst荧光染色法、原位末端标记(TUNEL)法、DNA凝胶电泳及流式细胞术(FCM)观察华蟾素对人白血病细胞株Jurkat的增殖、细胞凋亡、bcl-2表达的影响;在DBA/2小鼠的腹腔中注射L1210细胞,比较治疗组和对照组小鼠的生存期,评价药物疗效。结果:与对照组相比,1∶100～1∶25浓度的华蟾素能明显抑制Jurkat细胞生长,Hoechst荧光染色可见典型的凋亡形态学改变,TUNEL可见深棕色凋亡细胞,DNA电泳出现凋亡特有的“梯子”式条带,AnnexinV/PI双染色的FCM也证实凋亡的存在。在经1∶100、1∶50、1∶25浓度的华蟾素处理2d后,细胞凋亡率分别为18.78%、24.40%和40.29%。凋亡细胞的bcl-2表达由44.07%下调至16.30%。动物实验中,L1210白血病腹水瘤小鼠经华蟾素治疗后,生存期延长35.90%。结论:华蟾素能抑制Jurkat细胞生长并诱导凋亡,可能是通过下调bcl-2的表达来实现。动物实验证实,华蟾素能延长L1210白血病腹水瘤小鼠的生存期。     

砷诱导Jurkat T淋巴细胞铁蛋白重链的表达

目的了解三氧化二砷诱导人Juikat T淋巴细胞的差异表达基因，探讨砷对淋巴细胞基因转录的影响机制。方法在体外用三氧化二砷(5μmol／L．24h)处理人Jurkat T淋巴细胞后．应用抑制性消减杂交技术(ssH)和基因克隆技术构建差异表达的cDNA文库，用PCR技术和测序技术鉴定阳性克隆。结果用SSH技术构建了由三氧化二砷诱导的人Jurkat T淋巴细胞的差异表达基因的正向消减cDNA文库。经测序分析结果显示，铁蛋白重链在正向消减cDNA文库中有2个阳性克隆。结论三氧化二砷可诱导铁蛋白重链的表达，铁蛋白重链在淋巴细胞抗砷损伤机制中可能起着一定的作用。     

急性白血病细胞体外对Jurkat细胞凋亡的影响

为探讨白血病细胞凋亡相关基因 (Fas)的功能性表达情况 ,将 2 7例白血病患者的白血病细胞与 Jurkat细胞体外孵育后 ,用原位末端标记法 (TUNEL )测定单纯 Jurkat细胞 (对照组 )、不加和加入不同浓度抗凋亡相关基因配体 (Fas L)的 Jurkat细胞凋亡率。结果显示 ,不加抗 Fas L 急性非淋巴细胞白血病组 (ANL L 组 )与对照组比较 ,凋亡率明显增高 (P<0 .0 1) ,急性淋巴细胞白血病组 (AL L 组 )与对照组比较仅轻度增高 (P<0 .0 5 ) ,两者均随细胞浓度的增加而凋亡率增高 ;ANL L组加与不加抗 Fas L 相比凋亡率明显减少 (P<0 .0 1) ,随抗 Fas L浓度的增加而凋亡率减少 ,AL L 组加与不加抗 Fas L 相比凋亡率轻度减少 (P<0 .0 5 ) ,也随抗 Fas L 浓度的增高而减少 ,但不如 ANL L组凋亡率变化明显。提示急性白血病细胞存在 Fas L的功能性表达 ,ANL L较 AL L的 Fas L表达高     

苯乙酸钠诱导Jurkat细胞凋亡机制研究

目的:探讨苯乙酸钠(Sodium pheny-acetate,NaPA)诱导Jurkat(人粒细胞白血病细胞株)细胞凋亡机制及对细胞周期各时相的影响。方法:应用MTT比色法及流式细胞仪检测NaPA对Jurkat细胞的增值抑制率及细胞周期各时相的变化,并通过电子显微镜观察Jurkat细胞的亚细胞结构改变。结果:NaPA对Jurkat细胞增殖有明显的抑制作用,抑制率为27%~58%,且呈剂量依赖性。流式细胞仪结果表明,G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,细胞凋亡率增高,电子显微镜下可见线粒体肿胀,细胞核固缩。结论:NaPA能够抑制Jurkat细胞G1期向S期转化进程,诱导Jurkat细胞凋亡。     

在不同应激状态下MDM2基因对Jurkat细胞的作用

【目的】探讨MDM2基因在不同应激状态下对T细胞性白血病细胞株Jurkat增殖、凋亡和基因表达的影响。【方法】采用RNA干扰下调白血病细胞株Jurkat MDM2基因表达后，用Western blot、流式细胞术等方法检测Jurkat细胞在不同应激状态下的变化。【结果】无应激状态下，MDM2基因表达下降后，Jurkat细胞增殖减慢，细胞周期表现一定程度的G1-s阻滞；E2F1表达明显降低超过78％，p65表达下调超过58％；细胞损伤后，MDM2表达下调可导致细胞损伤修复减慢，增强紫外线和甲氨喋呤诱导凋亡作用，导致甲氨喋呤作用下Rb和Bax基因的表达相对增加。【结论】在不同应激状态下，MDM2基因表达下降广泛影响Jurkat细胞的增殖、凋亡和基因表达等生物学特性，提示MDM2基因有可能作为T细胞性白血病治疗的潜在新靶点。