The utility of cerebrospinal fluid for the molecular diagnosis of toxoplasmic encephalitis

The aim of this study was to assess the efficacy of nested polymerase chain reaction (PCR) and the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay, which were developed to detect and identify toxoplasma parasites in human cerebrospinal fluid (CSF). Nested PCR was performed using primers generated by Dr. L.D. Sibley to target the 18S rDNA instead of the conventionally used primers which target the B1 gene. We also designed Toxoplasma gondii–specific LAMP primers targeting both genes. In vitro detection sensitivity was evaluated using 10-fold serially diluted genomic DNA purified from RH tachyzoites, and clinical sensitivity and specificity were evaluated using clinical CSF samples from 16 patients with toxoplasmic encephalitis (TE) and from 12 patients with other diseases. The 18S rDNA nested PCR showed the highest detection sensitivity limit with a minimum of 1.0 × 10⁻⁸ ng/μL. However, sensitivity and specificity of nested PCR with clinical specimens were 50% and 100%, respectively. The sensitivity of molecular diagnosis of TE is not sufficient; therefore, patients clinically suspected of having TE should be treated promptly. Our molecular diagnostic tool would restrictively facilitate a definitive diagnosis of TE at an early stage in approximately 50% of patients.     

多重PCR快速检测3种食源性致病菌

目的建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌3种致病菌的多重PCR检测方法。方法采用LB培养液对金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌标准菌株进行增菌。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、产单核李斯特氏菌的hlvA基因、沙门氏菌的invA基因设计引物,通过多重聚合酶链反应（PCR）对上述3种食源性致病菌的目的基因进行扩增,同时对反应体系进行优化。结果对平均浓度为5cfu／ml的金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门氏菌在LB培养液中进行8h振荡培养,可以检出阳性结果;把金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、沙门菌、志贺菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌0157、阪崎肠杆菌7种菌混合在一起提取混合基因组DNA进行PCR扩增,显示出很好的特异性结果。结论建立的多重PCR检测方法适用于金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌的快速检测,具有快速、简便、灵敏的特点,可广泛应用于食品卫生检测、食物中毒应急处理和临床检验等领域。     

急性白血病细胞中ID4基因甲基化的PCR定量检测系统的建立及其特异性和敏感性

ID4基因启动子区甲基化发生率在急性白血病中极高,甲基化程度与急性白血病关系密切。因缺少合适的研究方法,其具体的甲基化量化水平与疾病的关系,人们一直缺乏认识。本研究旨在建立ID4甲基化定量PCR体系,同时验证该方法的特异性及敏感性,并初步尝试在初治急性白血病骨髓样本中评估ID4的甲基化水平。首先构建质粒并建立体系标准曲线,分别使用MSP和定量MSP对细胞系样本进行检测,以传统MSP的结果为对照,验证新方法的特异性;按不同比例将甲基化阴性和阳性细胞混合,用甲基化定量PCR扩增验证新方法敏感性。结果表明,本研究成功建立了符合绝对定量要求的标准曲线;通过细胞系验证,MSP结果与定量MSP结果完全一致;同时在甲基化阴性细胞背景下,定量MSP可以稳定的检测到1：10-5水平的ID4甲基化阳性细胞。在急性白血病骨髓样本检测中,定量MSP甲基化阳性检出率高于MSP。结论：本研究成功建立了完整的ID4基因甲基化定量PCR体系,该方法特异性好、敏感性高。     

SSOP HD试剂HLA高分辨分型结果不确定的原因分析

目的使用SBT法对SSOP HD试剂分型结果不确定的22份样本进行检测,分析可能的原因。方法对血液样本抽提DNA,按照SSOP HD试剂进行分型检测;针对结果不确定的样本采用SBT法复检,根据SBT法的测序结果分析22份样本SSOP结果不确定的可能原因。结果 2 000份样本经SSOP HD试剂检测后,结果不确定样本共有22份,A位点有6份,B位点有12份,DRB1位点有4份;SBT法检测均为明确的高分辨结果;分析原因可能为磁珠的假阳性或假阴性反应影响软件结果判读;或HLA基因型为罕见型;或试剂的局限性导致两种基因型不能区分。结论 SSOP HD可完成大批量样本的HLA高分辨检测工作;对罕见基因型和磁珠假性反应调整后的结果,应结合SBT法进行核实,保证HLA基因高分辨分型结果的准确性。     

IL －6／STAT3信号通路在脓毒症早期大鼠下丘脑－垂体－肾上腺轴中的表达及意义

目的：探讨大鼠脓毒症早期出现的HPA轴过度激活与IL－6／STAT3信号通路的内在联系。方法24只健康雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组（ Control组）、假手术组（ Sham组）、模型组（CLP组）三组。采用盲肠结扎穿孔（CLP）法建立脓毒症模型,术后6 h处死,分离出下丘脑、垂体、肾上腺组织。 RT－PCR检测下丘脑组织CRH、IL－6、STAT3、SOCS3 mRNA水平,垂体组织阿片促黑色素原（ POMC）、IL－6、STAT3、SOCS3 mRNA水平,肾上腺组织 IL－6、STAT3、SOCS3 mRNA水平。结果 CLP组较Control组、Sham组下丘脑组织中CRH、IL－6、STAT3、SOCS3 mRNA表达水平明显增加（P＜0.01）,垂体组织中POMC、IL－6、STAT3、SOCS3 mRNA表达水平明显增加（P＜0.01）,肾上腺组织中IL－6、STAT3、SOCS3 mRNA表达水平明显增加（P＜0.01）。Control组与Sham组各指标比较差异无统计学意义。结论脓毒症早期出现的HPA轴过度激活与IL－6／STAT3信号通路有着密切联系。针对IL－6／STAT3信号通路这一靶点进行干预,有望改善脓毒症状态下HPA轴的过度激活,为脓毒症的治疗提供新的思路。     

国产和进口荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比对分析

目的分析国产和进口实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂检测乙型肝炎病毒(HBV)-DNA的相关性,探讨国产和进口试剂在临床应用中的差异。方法使用国产和进口试剂平行检测262例乙型肝炎(乙肝)患者血浆当中的HBV-DNA水平,国产试剂采用手工提取标本,罗氏LightCycler480Ⅱ(LC480Ⅱ)进行核酸扩增;进口试剂则采用罗氏COBAS AmpliPrep(CAP)和COBAS Taqman48(CTM)进行标本提取和扩增;对HBV-DNA病毒载量数据进行对数转换(log10),并将两组数据进行相关分析。结果国产和进口试剂检测结果,经线性拟合,R2=0.814 3。HBV-DNA浓度在10~103 IU/mL的标本,R2=0.300 6;浓度在104~105 IU/mL的标本,R2=0.411 8;浓度在106~108 IU/mL的标本,R2=0.801 7。进口试剂阳性检出率为75.57%(198/262),明显高于国产试剂阳性检出率[65.65%(172/262)]。结论国产试剂和进口试剂相比,相关性良好。HBV-DNA浓度在106~108IU/mL时,相关性最高;浓度在104~105 IU/mL时,相关性一般;浓度在10~103 IU/mL时相关性较差,国产试剂与进口试剂有明显差异,灵敏度有待进一步提高。     

荧光定量PCR检测梅毒螺旋体方法的建立及初步应用

目的采用二聚体蝎型探针技术建立一种高敏感性和特异性的检测梅毒螺旋体(TP)的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法根据TP特异性外膜蛋白Gpd的基因序列设计引物和荧光探针,采用基因工程技术构建可用于TP定量的标准品,优化荧光定量PCR的反应体系和反应条件,建立检测TP的二聚体蝎型探针定量PCR。采用本研究建立方法和商品化荧光定量PCR试剂盒检测40例临床标本,对比分析检测结果的统计学差异。结果成功构建了TP重组质粒标准品和TP的二聚体蝎型探针定量PCR,该方法线性范围为101~108 copy/mL,灵敏度为10copy/mL,特异性和敏感性均为100.0%;二聚体蝎型探针定量PCR对疑似梅毒病例阳性检出率显著高于目前商品化Taqman荧光定量PCR试剂盒(82.5%vs 62.5%,P0.05)。结论成功建立了二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测TP的方法,为临床上TP的早期诊断和防控奠定了基础。     

用逆转录酶／聚合酶链反应方法检测急性粒细胞白血病（M_（2b））AML_1－E

用筑巢式逆转录酶／聚合酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）方法检测伴ｔ（８：２１）染色体易位的Ｍ＿（２ｂ）型白血病ＡＭＬ＿１－ＥＴＯ融合基因转录本，该方法具有高度敏感性，可以从１０￣４～１０￣５个正常细胞ＲＮＡ中检出１个白血病细胞，对于Ｍ＿（２ｂ）型白血病的诊断及监测是一种快速、灵敏、特异的方法。我们研究的１１例Ｍ＿（２ｂ）型白血病中有１例未检测到ＰＣＲ产物，可能与该型患者中基因重组的分子异质性有关。     

扬州、无锡两地男性STD6种支原体感染研究

目的 :我们研究了扬州和无锡两地区男性STD患者解脲脲原体 (Uu)、人型支原体 (Mh)、肺炎支原体 (Mpn)、生殖支原体 (Mg)、发酵支原体 (Mf)、穿通支原体 (Mpe)等支原体感染状况。 方法 :应用nestedPCR(nPCR)和DNA全自动测序技术对扬州和无锡地区的各 5 6例男性STD者的尿道拭子进行Uu、Mh、Mpn、Mg、Mf、Mpe等 6种支原体联合检测。 结果 :扬州地区男性STD者Uu、Mh、Mpn、Mg、Mf、Mpe阳性率分别为 6 9 6 %、35 7%、2 8 6 %、16 1%、3 6 %和 3 6 % ;无锡地区则为5 5 4%、32 1%、5 4%、5 4%、1 8%和 0 % ,二地区均存在多种支原体合并感染。结论 :本文认为扬州和无锡地区男性STD患者中都有较高的支原体感染率 ,特别是在国内首次从STD者的尿道拭子中通过nPCR法检测到穿通支原体     

多重PCR在瘢痕疙瘩Fas基因突变分析中的应用

目的:建立瘢痕疙瘩Fas基因常见突变外显子的多重PCR扩增反应体系,以利进行批量瘢痕疙瘩基因突变的筛选和检测。方法:取正常皮肤、增生瘢痕和瘢痕疙瘩组织DNA样本,根据瘢痕疙瘩Fas基因易发突变的外显子6,8,9之序列,按照多重PCR引物设计原则,建立3对相应引物,先分别找出各外显子的最佳扩增条件,再进行综合分析,最终找到一个理想的多重PCR扩增条件。结果:各外显子单一扩增片段和多重PCR扩增条带均清晰,产量较高,无非特异性扩增,产物长度与理论值一致;DNA测序证实,各扩增产物即各外显子基因片段。结论:成功建立了瘢痕疙瘩Fas基因常发突变外显子的多重PCR扩增体系,与以往单基因分次扩增相比,实现了一次同时扩增3个基因片段,为瘢痕疙瘩基因诊断和进一步相关的分子生物学研究提供了一个经济、快捷的方法,对于瘢痕疙瘩Fas基因的突变研究具有较高的应用价值。