中华按蚊实验室种群中肠内细菌菌群分析

目的为获取实验室饲养的3个发育期中华按蚊中肠内的革兰氏阴性菌菌株。方法取实验室饲养的20只中华按蚊吸血成蚊的中肠,研磨稀释后涂板培养,挑取单个菌落,培养扩增。以各菌株的DNA为模板,对16SrRNA基因的V3高变区进行PCR扩增、测序和Blast分析。对经鉴定的各类细菌进行革兰氏染色。以中华按蚊的Ⅳ龄幼虫(10只)、刚羽化雌成蚊(50只)和吸血雌成蚊(20只)等3个发育期的中肠基因组DNA为模板,用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)分析3个发育期中肠细菌16SrDNAV3区序列;建立在3个发育期均存在的16SrDNAV3区的克隆文库,并进行测序分析。将两种方法获得的16SrDNAV3区序列进行亲缘关系分析,确定同种的革兰氏阴性菌。结果从吸血成蚊的中肠分离到28个菌株,经分类鉴定为5种细菌,除短芽孢杆菌革兰氏染色呈阳性外,气单孢菌、丛毛单胞菌、金黄杆菌和A4菌均为革兰氏阴性菌。DGGE分析显示,共检测到4组条带在3个发育期均存在,经序列分析来源于5种细菌,分别为气单孢菌、A4菌、假单胞菌、无色杆菌和某未知菌种,其中气单孢菌(GQ301543)和A4菌(FJ8701127)来源的16SrDNAV3区与分离得到的该两种菌株的序列一致性均为100%。结论获得2种在中华按蚊3个发育期中肠内均存在的革兰氏阴性菌株,分别为气单孢菌和A4菌。     

人F3-GRIM19基因的克隆与表达

目的:克隆GRIM19基因,并构建F3-GRIM19表达载体. 方法:从正常人胎盘组织中克隆GRIM19的cDNA,并构建了F3-GRIM19表达载体,测序正确后,表达并亲和层析纯化F3-GRIM19融合蛋白．结果:克隆后测序,发现其含有约580 bp的插入片段,基因与GenBank序列完全一致,读码框正确．在大肠杆菌中表达Mr 25 000的F3-GRIM19蛋白,灰度值分析表达量约占菌体总蛋白的25％．经纯化,目的蛋白纯度达90％,复性率为17.3％．结论:成功构建了F3-GRIM19原核表达载体,并成功表达纯化了目的蛋白．     

慢性乙型肝炎患者病毒准种特性的初步研究

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)是否存在准种特性,并初步了解HBV准种的复杂性和遗传差异性。 方法用多聚酶链反应(PCR)技术从1例CHB患者血清中扩增HBV整个PreC/C基因区,然后用T载体克隆PCR产物,从转化阳性的克隆中随机选出34个克隆进行核酸序列分析。结果在34个测序克隆中发现存在28种不同的序列,序列间差异性介于0.2％～2.1％。变异位点分布于整个区域。所有序列nt1896位均无变异。 结论 在CHB患者体内HBV存在复杂的准种特性。     

多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆及序列分析

从自然感染的羊脑内采集脑多头蚴原头节,提取总RNA。根据亚洲牛带绦虫的TaHc2-D11 mRNA序列设计特异引物,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因。PCR产物连接到pMD18-T载体构建重组质粒pMD-TmTPx,转化大肠埃希菌DH5α后筛选阳性克隆,经限制性酶切及测序鉴定后进行序列分析。扩增获得大小为614bp的TmTPx基因cDNA,该基因的完整开放阅读框架(ORF,591bp)编码196个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为Mr 21690,等电点为7.61。生物信息学分析结果表明TmTPx具有一个典型的2-Cys Prx保守功能结构域。绦虫已知TPx的分子进化分析发现,多头带绦虫与亚洲牛带绦虫的亲缘关系最近,与猪带绦虫和肥头绦虫的亲缘关系次之,与细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的亲缘关系最远。     

德国小蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及免疫活性测定

目的克隆德国小蠊精氨酸激酶(arginine kinase,AK)全长基因,表达、纯化重组AK蛋白,并研究蛋白的免疫反应性。方法提取德国小蠊总RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,PCR克隆德国小蠊AK片段,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达和纯化结果,用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组AK蛋白的免疫反应性。结果德国小蠊AK基因开放阅读框全长为1071bp,编码356个氨基酸,GenBank登录号为FJ514482。与GenBank中已登录的德国小蠊序列(登录号为EU429466)比对,同源性达97.2%。重组质粒pET-28a-AK在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为45 000,主要以可溶性形式表达,经亲和层析获得目的蛋白。Western blotting分析结果表明,重组AK蛋白可被过敏性患者血清识别,免疫反应...     

HAb25肝癌单克隆抗体可变区基因的克隆和序列测定

目的克隆ＨＡｂ２５肝癌单克隆抗体（ＭＣＡｂ）的可变区基因。方法ＲＴ－ＰＣＲ＄从分泌ＨＡｂ２５单克隆抗体的杂交瘤细胞中,扩增出ＶＨ和ＶＬ基因,双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果ＶＨ和ＶＬ基因的两端均含有完整的引物序列,ＶＨ基因全长３６０ｈＰ,编码１２０个氨基酸,ＶＬ基因全长３３０ｈＰ,编码１１０个氨基酸,重、轻链可变区内均仅含单一开放读框,具有明显的抗体可变区特征,与基因数据库（ＧｅｎＢａｎｋ冲的序列进行比较分析,基因库中无相同的基因,ＶＨ基因与小鼠重链ＶＨ１８６．２家族同源性最高（８４．００％）,属小鼠屹重链可变区９个家族中的第三族,ＶＬ基因与小鼠ｋａｐｐａ轻链ＭＭＩｇＧＫＡＶＡＧ基因同源性最高（８２．００％）,属小鼠Ｉｇｋａｐｐｐａ轻链第ＩＶ组。结论克隆的ＨＡｂ２５ＭｃＡｂ的可变区基因为功能性重排的小鼠可变区基因。     

细粒棘球绦虫亲环蛋白基因的克隆 重组表达和生物信息学分析

目的 克隆表达细粒棘球绦虫亲环蛋白 （EgCyP） 基因, 并对其进行生物信息学分析。方法 从细粒棘球绦虫cD? NA中扩增目的基因, 克隆入表达载体pET28a, 转化大肠埃希菌 （E.coli） BL21 （DE3）, 经异丙基?β?D硫代半乳糖苷诱导表达后, 进行SDS?PAGE和免疫印迹试验鉴定, 并对其进行生物信息学分析。 结果 重组质粒pET28a?EgCyP构建成功。SDS? PAGE和免疫印迹试验结果显示, 重组蛋白在E.coli BL21 （DE3） 中获得高效表达, 重组蛋白EgCyP分子量约为22 kDa, 可被细粒棘球绦虫感染犬血清识别。生物信息学分析显示该蛋白具有7个潜在的抗原表位。 结论 成功克隆出细粒棘球绦虫EgCyP基因并在E.coli BL21 （DE3） 中表达, 为进一步研究其免疫原性奠定了基础。     

细粒棘球绦虫烯醇酶基因克隆 表达及免疫诊断研究

目的克隆表达细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEno)基因,并对其免疫诊断价值进行初步评价。方法从细粒棘球绦虫cDNA中扩增目的基因,克隆入表达载体pET28a,转化E.coliBL21(DE3),经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,进行SDS PAGE和免疫印迹法鉴定;采用细粒棘球蚴病及其他几种寄生虫病患者的血清和健康人血清,通过ELISA法评价重组EgEno抗原的免疫诊断效果。结果重组质粒pET28a EgEno构建成功。SDS PAGE和免疫印迹法结果显示,重组蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,重组蛋白EgEno相对分子量约为50 kDa,可被细粒棘球蚴病患者血清识别。EgEno对细粒棘球蚴病患者血清的免疫诊断敏感性为81.25%。结论克隆出细粒棘球绦虫EgEno基因并在E.coliBL21(DE3)中表达,重组EgEno对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。     

幽门螺杆菌GGT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆幽门螺杆菌( H pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在大肠杆菌中的表达.方法: 从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,酶切和测序验证,构建原核表达载体pET-28a(+)-GGT,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析检测表达产物.结果: 成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pET-28a(+)-GGT质粒,高效表达出了68 kDa的融合蛋白.结论: 在大肠杆菌中成功表达了GGT重组融合蛋白,为进一步研究GGT与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系奠定了基础.     

脑梗死患者载脂蛋白(a)基因TTTTA五核苷酸重复序列多态性

载脂蛋白 (a) 5’端侧翼存在一个TTTTA五核苷酸重复序列 ,为探讨中国汉族人群中载脂蛋白 (a)TTT TA五核苷酸重复序列多态性与动脉硬化性脑梗死的关系 ,采用聚合酶链反应、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染等技术分析湖北地区 82例脑梗死患者和 15 3例正常汉人TTTTA五核苷酸重复序列 ,同时采用T载体快速克隆载脂蛋白 (a) (TTTTA) 5等位基因并对其测序。共检出TTTTA串联重复次数为 4、5、7、8、9、10和 11共 7种等位基因和 4/ 8、4/ 9、5 / 8、5 / 9、7/ 8、8/ 8、8/ 9、8/ 10、8/ 11、9/ 9和 9/ 10等 11种基因型 ,脑梗死组载脂蛋白 (a)TTTTA重复序列为 5的等位基因频率明显高于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ,重复序列为 9的等位基因频率明显低于正常对照组 (P<0 .0 1) ,测序结果表明 (TTTTA) 5等位基因未发现其有基因变异。结果提示极有可能是 (TTTTA)的重复数目不同与脑梗死发生关联。