抗Ia单克隆抗体促进异基因皮肤移植耐受

目的:探索抗Ia单克隆抗体促进"细胞+环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)"系统诱导移植耐受的作用及其机制.方法:BALB/C(H-2d)小鼠经尾静脉注入C57BL/6(H-2b,B6)小鼠脾细胞,48 h后腹腔注射CP,接着两天分别经尾静脉注入抗小鼠Ia单克隆抗体500 μg,然后进行皮肤移植,并于耐受30 d对受体小鼠作混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)、迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)等耐受状态的检查.结果:B6小鼠的皮肤移植物在耐受BALB/C小鼠中存活期特异性延长,MLR和DTH检查证明BALB/C小鼠对B6小鼠的脾细胞产生特异性耐受,对无关第3者KM小鼠的脾细胞仍表现出强烈的免疫反应.机制研究发现,克隆不应答(anergy)和抑制细胞在耐受中起作用.结论:抗Ia单克隆抗体可明显促进"细胞+CP"诱导的异基因皮肤移植耐受.克隆不应答和抑制细胞是耐受的主要机制.     

人乳铁蛋白提高MCF7细胞放射敏感性的初步研究

目的 观察hLF对于人乳腺癌细胞辐射敏感性的影响。方法 用pBC1-hLF载体转染MCF7细胞,同时以hLF标准品处理为参照,细胞活力实验、克隆形成试验和流式检测细胞凋亡来观察hLF基因高表达对MCF7细胞生长特性和辐射敏感性的影响。结果 hLF基因高表达可以显著抑制MCF7的生长,提高其对射线的敏感性。hLF可促进MCF7细胞自发和受照后的凋亡,降低克隆形成能力。但胞外直接供给hLF却不能抑制MCF7的生长,也不能显著提高其对射线的敏感性,甚至有提高克隆形成能力的趋势。结论 hLF基因高表达可以在体外显著抑制人乳腺癌MCF7细胞的生长,提高其辐射敏感性,而直接供给hLF却没有上述作用。     

直接测序与克隆测序检测不育男性H19基因甲基化印记的比较

目的建立亚硫酸氢盐修饰后测序技术,比较直接测序与克隆测序在不育男性精子印记基因DNA甲基化状态检测中的差别。方法对样本进行精液分析和精子形态学分析,密度梯度离心法制备精液。提取精液基因组DNA并行亚硫酸氢盐处理,行半巢式PCR,将纯化后PCR产物与pCR?2.1-TOPO?载体连接及转化,分别对PCR产物及阳性克隆菌液进行测序。结果 PCR产物直接测序,前半部分序列丢失约40bp,1号CpG位点甲基化状态信息丢失。每例标本只有一个测序结果,会出现CpG位点的部分甲基化状态。挑取15个克隆进行测序,序列无丢失,18个CpG位点甲基化状态信息均完整。15个克隆CpG位点甲基化状态有所不同,显示出此样本的平均甲基化状态。结论克隆测序不会造成序列丢失,CpG位点甲基化状态信息完整,克隆测序能较好地反应样本的平均甲基化状态。     

重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒的构建

目的构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1IGF-1),为基因治疗脊髓损伤(SCI)提供前提。方法应用反转录聚合酶链反应(RTPCR)方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1(IGF1)基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFPN1上,以构建重组质粒pEGFPN1IGF1。结果实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以RTPCR方法获取编码IGF1基因的全序列cDNA。构建IGF1cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在IGF1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实结果。结论构建重组质粒pEGFPN1IGF1成功,实验中将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在IGF1基因的3′端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,既保留了IGF1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

炭疽芽胞杆菌致死因子在大肠埃希菌中的表达与纯化

目的在大肠埃希菌中表达炭疽致死因子,获得纯化蛋白,用于炭疽快速诊断方法以及炭疽致病机制研究。方法 PCR方法扩增炭疽致死因子,构建表达质粒pETLF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,通过Ni离子金属螯合树脂进行纯化,Western blot(WB)试验检查免疫原性,MTT方法检查生物学活性。结果获得重组炭疽致死因子,WB结果显示重组蛋白具有良好的免疫反应性,MTT方法进行的生物学活性测定表明致死因子与保护性抗原联合,细胞毒性与文献报道相比有明显降低。结论所获得的重组炭疽致死因子,对于发展炭疽快速诊断方法,以及研究炭疽毒素的作用机制具有一定的促进作用。     

H5N1型流感病毒M2蛋白全长编码基因的克隆与原核表达

目的:构建H5N1流感病毒基质蛋白M2基因的原核表达系统,为研究其在体液免疫中的作用奠定物质基础。方法:应用PCR方法从流感病毒H5N1cDNA中扩增出M2的全基因序列,插入至表达质粒载体pGEX6P-3上,构建重组原核表达质粒pGEX-6p-3/M2。重组质粒经测序分析确认后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达M2蛋白后,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western Bloting分析。结果:PCR扩增的M2基因长度为297bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GeneBank公布的序列相似性达100%;SDS-PAGE和Westem Bloting分析显示,经IPTG诱导出分子质量为37.2 KD的目的蛋白。结论:成功构建了H5N1流感病毒基质蛋白M2原核表达载体pGEX-6p-3/M2,并在大肠杆菌中获得表达。     

阪崎肠杆菌外膜蛋白基因的克隆与序列分析

目的:扩增并分析阪崎肠杆菌外膜蛋白基因。方法:根据肠杆菌外膜蛋白A基因的序列特点,设计引物,扩增阪崎肠杆菌外膜蛋白A(ompA)序列,并通过T载体克隆后测序。结果:序列分析表明其1044 bp的序列全长编码347个氨基酸,具有肠杆菌科细菌外膜蛋白序列的典型特征。同源性分析表明,该序列与其它肠杆菌属细菌的序列进行比较,其核酸序列同源性为86%到99%。结论:结果表明该序列为阪崎肠杆菌外膜蛋白基因。     

结核分枝杆菌Rv3914抗原的克隆表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv3914蛋白的重组质粒,并在大肠埃希菌中表达及纯化,为结核病血清学诊断提供候选抗原。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv3914基因片段,插入到pET-28b(+)载体中,构建pET28b-Rv3914重组质粒,转化大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3),经IPTG诱导表达后,应用Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白。结果 PCR扩增出Rv3914基因序列,重组质粒经测序并经BLAST分析后发现无点突变。pET28b-Rv3914重组质粒在大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,重组蛋白占细胞蛋白总表达量的30%以上,经Ni-NTA柱纯化后,得到纯度超过90%、相对分子质量约为14.7×103的目的蛋白质。结论高纯度结核分枝杆菌Rv3914重组蛋白的获得为研究结核互补特异性抗原组合在结核病血清诊断中的价值奠定了基础。     

人型结核杆菌克隆DNA探针的制备及其应用的研究

用限制性内切酶ＰｓｔⅠ消化人型结核杆菌Ｈ３７ＲｖＤＮＡ,与质粒ｐＵＣ１９ ＤＮＡ连接后转化大肠杆菌,经同位素３２Ｐ标记的人型结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ全染色体ＤＮＡ探针筛选出６个阳性克隆（ＭＴ１￣６）,其中克隆ＤＮＡ片段ＭＴ２（４．２Ｋｂ）、ＭＴ４（３．５Ｋｂ）和ＭＴ５（３．０Ｋｂ）标记成探针,检测了２２种分支杆菌标准株和１５侏人型结核杆菌临床分离侏以及２种非分支杆菌,其杂交结果完全相同,与人型结核杆菌及     

pcDNA3．1（＋）／NspA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建pcDNA3.1( )淋病奈瑟菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface Protein A,NspA)基因真核表达载体,为研制淋病奈瑟菌核酸疫苗奠定基础。方法根据淋病奈瑟菌NspA基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出NspA基因片段,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1( )/NspA,进行酶切、PCR及测序鉴定。结果NspA基因体外扩增产物大小约为525 bp。所构建的pcDNA3.1( )/NspA重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片断的大小相符;测序结果与GenBank中收录的NspA全长序列一致,表明pcDNA3.1( )/NspA真核表达载体构建正确。结论成功地构建了淋病奈瑟菌真核重组表达载体pcD-NA3.1( )/NspA,为NspA蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌核酸疫苗的研制提供了物质基础。