单纯疱疹病毒DNA部分BamHI酶切片段在大肠杆菌内克隆的研究

单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)标准株SM_(44)DNA部分BamH Ⅰ酶切片段用T_4DNA连接酶在体外与pBR_(322)重组,转入大肠杆菌内,共获得重组菌58株。用质粒快速抽提方法,检测重组菌有无质粒及质粒的大小,从中选出H_(919)菌株做鉴定。经纯化质粒、酶切和核酸杂交试验,证明该菌株的质粒插有分子量近似1.51×10~6 daltons,约含2322bp的SM_(44)DNA片段。     

人肺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选

目的 筛选高低转移能力人肺癌细胞株PG-BE1和PG-LH7间差异表达基因.方法 进行两次抑制性消减杂交,第一次以PG-BE1细胞株为实验方、PG-LH7株为驱动方构建正向消减文库;第二次以PG-LH7株为实验方、PG-BE1为驱动方构建反向消减文库.筛选出来的阳性克隆进行测序,并在Gene Bank数据库中进行同源性比较.结果 2个消减文库共得到122个阳性克隆,随机选取10个克隆测序并进行同源性分析,发现其中9条序列来自于已知基因,另外1条序列为新的基因序列标签.结论 成功构建了高低转移力人肺癌细胞株的双向消减杂交文库.     

抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定

目的 构建抗甲胎蛋白(AFP)重链可变区(VH)单域抗体融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达,并初步鉴定表达产物的活性.方法 从已构建的抗AFP单链抗体(ScFv)的载体中,经PCR扩增出VH 单域抗体基因,再克隆到融合蛋白表达载体pET32a( )中进行表达;用SDS-PAGE及Western-blot鉴定表达产物;并通过竞争抑制ELISA分析TrxA-VH融合蛋白的结合活性;细胞免疫组化染色分析其内化及结合情况.结果 VH 单域抗体基因全长339 bp,将其克隆到pET32a( )中,转化大肠杆菌可获得高效表达,Western-blot证实在相应分子质量处,有TrxA-VH融合蛋白的显色条带.经初步纯化和复性后,获得抗AFP的VH单域抗体融合蛋白.竞争抑制ELISA及细胞免疫组化证明,表达产物具有与AFP特异结合的活性.结论 成功构建了抗AFP的VH单域抗体融合蛋白,为临床的应用研究奠定了基础.     

肝素结合生长因子Midkine基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化

目的：用基因工程的方法构建、表达和纯化人肝素结合生长因子human Midkine（hMK），并进行活性测定。方法：利用RT-PCR技术从胎儿肾组织中扩增MK，将去除信号肽序列的hMK插入pET30a，构建成表达载体pET-hMK，经表达和亲和层析、纯化获得目的蛋白，3^H-TdR法测定活性。结果：hMK序列与Genebank发表的人MK基因编码序列一致，SDS-PAGE电泳显示表达出目的蛋白，3^H-TdR法测定有良好的活性。结论：人MK已被转人表达载体中，并在大肠杆菌中诱导表达，获得了hMK的表达菌株。     

斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的　克隆斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,并对其进行测序和序列分析。方法　利用简并引物 ,进行RT PCR ,扩增斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm T载体 ,进行鉴定、测序 ;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列 ,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果　RT PCR扩增出了一约5 0 0bp的cDNA片段 ,对阳性克隆测序后获得其核酸序列 ,长 4 95bp。将推导的氨基酸序列作同源性分析显示 ,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着较高的同源性 ,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论　克隆获得了斯氏肺吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,该片段包含了与半胱氨酸蛋白酶活性和空间结构相关的重要基因位点。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性，了解增强子增强转录效率的能力。方法采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA启动子和增强子序列，先后克隆到含有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒载体，脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在不同细胞的表达情况。结果成功构建质粒pEGFP—PS—MAPro和pEGFP-PSMAEP，转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的有效表达，且pEGFP—PSMAEP的调控转录能力较pEGFP—PSMAPro强20倍。结论PSMA启动子增强子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性，增强子能够明显增强启动子的转录效率，增加了目的基因的表达水平。PSMA启动子和增强子的共调控可以保证基因表达的强度和细胞特异性，为前列腺癌基因靶向性治疗研究提供实验依据。     

人胃动素受体基因表达载体的构建

目的 构建人胃动素受体基因的原核表达载体。方法 通过巢式PCR扩增人基因组DNA，获得人胃动素受体基因的658bp的靶片段，将其粘端克隆，然后应用限制性酶切、半巢式PCR扩增及测序鉴定。结果 成功克隆了人胃动素受体基因表达片段，测序证实读框正确。结论 人胃动素受体表达片段获得成功克隆。     

糖尿病并发症相关基因醛糖还原酶酵母细胞模型的建立

目的 构建由绿色荧光蛋白（GFP）标记的糖尿病慢性并发症相关基因醛糖还原酶（AR）表达载体，并在酵母细胞中表达，建立AR抑制剂筛选模型。方法 构建AR与GFP的嵌合基因，将此AR：：GFP嵌合基因克隆到酵母表达载体pYEX-BX中，再将重组载体pYEX-BX-AR：：GFP转化至酵母宿主菌INVSC1，在SC-UD选择性培养基中表达AR：：GFP。结果 PCR扩增出约l106bp大小片段，为AR基因片段；RT-PCR在酵母细胞中检测到ARmRNA的表达；经CuS04诱导后可见AR：：GFP融合蛋白的绿色荧光；诱导剂CuSO4终浓度在100～200μmol／L范围内相对荧光强度较高，细胞密度适中；培养基SC-UD的pH值为6左右最适合细胞生长和荧光表达。结论 AR：：GFP在酿酒酵母中成功地表达，酵母细胞是研究目的基因功能与表达的良好模式菌。     

16SrRNA克隆文库法分析成人龋病唾液微生物多样性

目的: 讨论汉族人群中高龋和无龋人群口腔唾液微生物结构的差异。方法: 采集符合WHO采样标准的唾液样本6例,其中高龋组(CA组)3例,无龋组(CF组)3例,提取细菌总DNA,构建16S rRNA克隆文库,挑取阳性克隆子进行测序,并用MOTHUR等软件对结果进行分析,MEGA4.0软件构建系统发育树。结果: 共获得80个OTUs,归属于5个门,9个纲,10个目,14个科,19个属,其中有13个优势属;CA组优势属为:链球菌属(53.16%)、普氏菌属(28.77%)、颗粒链球菌属(9.34%);CF组优势菌为:链球菌属(46.12%)、普氏菌属(23.41%)、奈瑟菌属(14.35%)。结论: 16S rRNA克隆文库法已成熟,可用于口腔微生物群落结构的研究,当地汉族人群中高龋和无龋人群口腔微生物群落结构存在一定的差异,高龋组中优势菌(链球菌属、普氏菌属、颗粒链球菌属)对龋病发生发展的作用还有待进一步的研究。