HIF-1α在大鼠角膜碱烧伤后的作用研究

目的检测大鼠角膜碱烧伤后缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达变化,探讨其在角膜碱烧伤损伤机制中的作用。方法建立大鼠角膜碱烧伤模型,采用免疫组织化学与原位杂交技术,检测角膜碱烧伤后不同时间HIF-1α在角膜各层中的表达变化。结果在正常角膜组织中,角膜各层均未见HIF-1α免疫染色,碱烧伤后1d时HIF-1α免疫活性增强,且3d时表达最强,15d时明显下降,30d时仍有高于正常水平的弱表达。原位杂交检测中正常角膜组织有极弱的HIF-1α mRNA表达,碱烧伤后HIF-1α mRNA表达增强,在伤后3d、7d时表达最明显,15d后表达强度恢复至正常组织水平。结论HIF-1α参与碱烧伤后角膜的损伤病理机制,其表达变化影响新生血管形成过程,为寻找角膜碱烧伤新的治疗途径提供了理论依据。     

Hypoxia/reoxygenation and TGF-beta increase alphaB-crystallin expression in human optic nerve head astrocytes

Reactive astrocytes in glaucomatous optic nerve changes are characterized by an increased expression of alphaB-crystallin and transforming growth factor-beta (TGF-beta). In the pathogenesis of glaucomatous optic nerve damage, ischemia/reperfusion injury may play an important role. The goal of the present study was to determine the influence of hypoxia/reoxygenation and TGF-beta on the expression of alphaB-crystallin in cultured human astrocytes of the optic nerve head (ONH). Cultured human astrocytes were incubated under hypoxic conditions (1% O2 for 4-12 h) with subsequent reoxygenation (12-24 h). Additionally, cells were treated with 1.0 ng/ml TGF-beta1 and TGF-beta2 for 12-48 h. Expression of alphaB-crystallin was examined by Northern- and Western-blotting. Levels of TGF-beta1 and TGF-beta2 were analyzed by RT-PCR analysis and ELISA. The effect of TGF-beta blocking on the hypoxia/reoxygenation modulated expression of alphaB-crystallin was investigated by simultaneous incubation with neutralizing antibodies against TGF-beta during the reoxygenation phase. Hypoxia/reoxygenation increased the expression of alphaB-crystallin at the mRNA (2.8- to 3.1-fold) and protein level (1.8- to 2.1-fold). Treatment with 1.0 ng/ml TGF-beta1 and TGF-beta2 for 12-48 h markedly enhanced alphaB-crystallin mRNA expression approximately three- to fourfold. Using Western blot analysis, this increase ranged from 2 to 3 times. Both cytokines showed a twofold increase after 12 and 24 h of reoxygenation at the mRNA and a two- to threefold increase at the protein level. Simultaneous treatment with neutralizing antibodies against both TGF-beta isoforms prevented the hypoxia/reoxygenation-mediated elevation of alphaB-crystallin. The process of hypoxia/reoxygenation is capable of inducing the expression of alphaB-crystallin and TGF-ss in cultured ONH astrocytes. Therefore, optimization of conditions leading to hypoxia/reoxygenation in the ONH of glaucomatous patients may help to lower the incidence of characteristic changes in the optic nerve.     

三种斑马鱼血瘀模型在三七抗血栓及抗心肌缺氧能力评价中的应用

目的:采用不同诱导剂建立3种斑马鱼血瘀模型,优选最适宜评价三七活血能力的模型。方法:花生四烯酸(AA),普纳替尼(Ponatinib),异丙肾上腺素(ISO)分别建立斑马鱼血瘀模型,设置正常组、模型组、阳性药组、不同浓度三七水提物冻干粉组,计算心脏红细胞染色强度、心脏凋亡细胞荧光强度,评价三七的抗血栓作用和抗心肌缺氧能力。基于优选的评价三七活血化瘀活性的血瘀模型—AA,ISO诱导的斑马鱼血瘀模型,比对三七水提取物及70%甲醇提取物之间的活性,并采用UHPLC LTQ-Orbitrap MS/MS技术比对其化学成分差异。结果:AA,Ponatinib诱导后斑马鱼心脏红细胞染色强度显著降低(P<0.01),ISO诱导后心脏凋亡细胞荧光强度显著升高(P<0.01),三七水提物冻干粉可以拮抗AA模型的血栓形成(P<0.01)和ISO模型的心肌凋亡(P<0.05),对Ponatinib模型血栓形成无显著改善作用。三七70%甲醇提取物冻干粉可以抑制ISO血瘀模型的心肌凋亡(P<0.01),作用强于三七水提物冻干粉,其成分差别主要在于人参皂苷Re等部分皂苷类以及氨基酸类...     

MiR-199a 修饰的间充质干细胞来源外泌体通过 Akt/HIF-1α/DRP1 轴促进缺糖缺氧/复糖复氧模型心肌细胞H9c2线粒体修复

目的 探讨miR-199a修饰的间充质干细胞（MSCs）来源的外泌体修复缺糖缺氧/复糖复氧模型心肌细胞H9c2线粒体的作用机制。方法 体外培养 MSCs,转染 miR-199a mimics 或 miR-NC,48～72 h 后收集外泌体,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测外泌体的 miR-199a水平。将 H9c2细胞分为对照组、模型组、miR-199a修饰外泌体（Exos^mimic,终质量浓度 50 μg·mL^-1）组、miRNA 阴性对照修饰外泌体（Exos^NC,终质量浓度 50 μg·mL^-1）组和 miR-199a修饰外泌体＋蛋白激酶 B（Akt）抑制剂（Exos^mimic＋MK2206 10 μg·mL^-1）组,除对照组外,制备缺糖缺氧/复糖复氧模型。应用 CCK-8 法检测各组细胞存活率,酶标仪检测各组细胞三磷酸腺苷（ATP）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平以及上清液8-羟基脱氧尿苷（8-OHdG）、乳酸脱氢酶（LDH）水平;共聚焦显微镜检测各组线粒体膜电位（ΔΨm）和线粒体动力学变化;Western blotting法检测各组缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和线粒体动力相关蛋白1（DRP1）蛋白表达变化。结果 与对照组比较,Exos^mimic中 miR-199a 表达水平明显升高（P＜0.05）,提取的外泌体直径平均为 109.3 nm,浓度为 1×10⁶颗粒·mL^-1。与对照组比较,模型组细胞存活率和ATP、SOD、ΔΨm水平显著下降,LDH、MDA、8-OHdG水平和HIF-1α和DRP1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01、0.001）,线粒体分裂水平增加;与模型组比较,Exos^mimic组细胞存活率和ATP、SOD和ΔΨm水平显著升高,LDH、MDA、8-OHdG水平和HIF-1α及DRP1蛋白表达水平显著下降（P＜0.01、0.001）,线粒体分裂水平减少;MK2206能明显逆转Exos^mimic效果（P＜0.05、0.01）。结论 miR-199a修饰的MSCs外泌体通过Akt/HIF-1α/DRP1轴促进缺糖缺氧/复糖复氧心肌细胞线粒体修复。     

藏红花素通过跨膜受体蛋白 /发状分裂相关增强子 1信号通路对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的影响

目的 探讨藏红花素对缺氧诱导的视网膜神经节细胞凋亡的作用及其可能机制。方法 于2021年1月至2022年1月采用不同浓度藏红花素处理视网膜神经节细胞RGC-5,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活情况并筛选合适浓度。培养RGC-5细胞并用氯化钴(CoCl₂)处理建立缺氧模型,分为缺氧组、藏红花素组、阳性对照(抗坏血酸)组和藏红花素+跨膜受体蛋白信号通路抑制剂(DAPT)组,另设对照组。Cell counting kit-8法检测细胞存活情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;钙荧光探针(Flou-4)实验检测各组细胞钙离子水平;实时定量PCR法检测跨膜受体蛋白(Notch1)、发状分裂相关增强子1(Hes-1)mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、钙依赖性蛋白酶家族1(Calpain1)蛋白表达情况。结果 藏红花素组细胞活力0.83±0.08高于缺氧组0.45±0.04,细胞凋亡率(17.92±1.21)%低于缺氧组(51.82±5.36)%,钙离子水平0.27±0.04低于缺氧组0.76±0.05,...     

视网膜中央静脉阻塞继发黄斑水肿抗VEGF治疗后出现棉绒斑增多2例

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion,RVO)是全球第二大高发的视网膜血管性疾病,按照其发病部位分为视网膜中央静脉阻塞（central retinal vein occlusion,CRVO） 和视网膜分支静脉阻塞（branch retinal vein occlusion,BRVO）,其发病机制复杂。目前抗血管内皮生长因子(anti-vascular endothelial growth factor,anti-VEGF)治疗是一线治疗,临床上发现2例患者在接受抗VEGF治疗后出现视网膜棉绒斑短暂性增多情况,本文推测棉绒斑的出现可能与眼内VEGF水平被过度抑制和炎症因子的高度表达造成视网膜急性缺血缺氧相关,但具体的分子机制还需要进一步研究证实。     

miR-519d-3p靶向HIF-1α抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能障碍及血管生成

目的:明确miR-519d-3p对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)功能障碍与血管生成的影响,并阐明其对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调控机制。方法:通过5、30mmol/L葡萄糖分别诱导HRMEC建立正常(NG)和高糖(HG)细胞模型。将HRMEC分为对照组(HG细胞模型转染阴性对照模拟物)、甘露醇组(对照组加入25mmol/L甘露醇)、miR-519d-3p过表达组(HG细胞模型转染miR-519d-3p模拟物)、miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组(HG细胞模型共转染miR-519d-3p模拟物和HIF-1α过表达载体)。实时荧光定量PCR法检测各组miR-519d-3p的表达情况。Western blotting法检测各组HIF-1α蛋白的表达情况。荧光素酶报告基因实验检测miR-519d-3p和HIF-1α的结合位点情况。CCK-8法检测各组细胞增殖情况。Hoechst 33342染色法检测各组细胞凋亡情况。ELISA法检测各组细胞外液炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6蛋白的表达情况。小管形成实验检测各组新生...     

缺氧条件下骨髓间充质干细胞对血管内皮细胞迁移和管腔形成的影响

目的:探讨缺氧条件下骨髓间充质干细胞(BMSCs)对血管内皮细胞迁移和管腔形成的影响。方法:制备3种细胞的条件培养基(CM),分别为对照组(血管内皮细胞培养基,VCM)、常氧条件下BMSCs的CM组(NCM)和缺氧条件下BMSCs的CM组(HCM)。分别用以上3种CM培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)和猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞(RF/6A)6~24h后,观察血管内皮细胞迁移和管腔形成的能力。结果:相对于对照组和常氧组的CM,缺氧组即HCM作用下的血管内皮细胞的迁移数目和成管数量(包括成管总长度和分支数)均显著增加(均P<0.05)。在RF/6A细胞,对照组VCM、常氧组NCM和缺氧组HCM作用24h后,迁移的细胞数分别为19.00±3.61、32.33±3.06、114.00±11.53个(F=153.3,P<0.001);而HUVECs的3组细胞迁移个数则分别是76.00±9.54、122.00±18.68、307.70±25.97个(F=121.5,P<0.001)。RF/6A细胞经各组CM孵育6h后,成管数目分别为12.00±3.00、37.00±4.58、51.00±3.61个(F=81.7,P<0.0001);3组HUVECs细胞管腔形成的结果类似。结论:缺氧条件下BMSCs可促进血管内皮细胞的迁移和成管能力,这种机制可能在视网膜新生血管中发挥作用。     

大鼠急性低氧运动对心肌细胞瞬时外向钾电流的影响

目的 通过建立大鼠急性低氧运动模型,观察大鼠单个心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的改变,在细胞水平探究模拟高原低氧条件下力竭运动对心脏电生理的影响.方法 将40只健康雄性清洁级SD大鼠随机分为低氧运动组、低氧安静组、常氧运动组和常氧安静组,每组10只.利用小动物低压氧舱和常氧状态下进行力竭运动试验.取出各组大鼠心脏,...