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101.
目的:研究重组小鼠干细胞逆转录病毒载体介导基因转染,探索一条高效基因转染的途径,为重组小鼠干细胞逆转录病毒载体在基因转染中的应用提供理论依据和奠定实验基础。方法:①逆转录病毒载体的构建:EC1-4(repeats1-4ofcadherin-5extracellulardomains)基因克隆产物和mutant(Ser222A)MEK1基因克隆产物,Bg1Ⅱ和EcoRⅠ限制性内切核酸酶切割后,克隆进入逆转录病毒表达载体pMSCV。②CD41+细胞的获取和细胞培养:从脐带血分离的CD34+细胞通过TPO诱导表达CD41,FACS分离CD41+细胞。高糖DMEM培养液培养NIH3T3和MDA-MB-435细胞,U937细胞培养在RPMI-1640培养液,UT7细胞是细胞因子依赖性细胞株,Iscove'smodifiedDulbeco's培养液中加入GM-CSF。③测定病毒滴度:逆转录病毒载体转入包装细胞293,36h后收集病毒上清液,感染NIH3T3细胞,流式细胞仪测定病毒滴度。④Westernblot:基因转染CD41+、UT7、U937和MDA-MB-435细胞,Westernblot检测基因产物的表达。结果:293细胞产生高滴度MEK1pMSCV病毒:3.1×107,高滴度EC1-4pMSCV病毒:1.0×108。用稀释8倍的病毒转染基因,重组逆转录病毒MEK1pMSCV转染白血病细胞株UT7和U973,GFP阳性细胞(转染阳性细胞)分别是60.73%、72.56%。重组逆转录病毒MEK1pMSCV转染原代培养细胞CD41+,GFP阳性细胞为30.57%。重组逆转录病毒EC1-4pMSCV转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-435,GFP阳性细胞为97.54%。TPO作用CD41+和UT7细胞以及血清对U973细胞的作用,显示出外源mutationMEK基因的dominantnegative的效应,实验组磷酸化的MEK1减少。EC1-4基因转染的MDA-MB-435细胞表达了EC1-4基因产物。结论:重组小鼠干细胞逆转录病毒载体能高效基因转染CD41+、UT7、U937和MDA-MB-435细胞,转染的基因能稳定地表达。 相似文献
102.
鸭乙型肝炎病毒DNA体内转染的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
利用两种鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA双体质粒及环化的DHBVDNA体内转染2d龄鸭及4~20d龄鸭,大多数鸭产生了短暂病毒血症,少数鸭产持续病毒血症,转染鸭血清中检测得DHBs/preSAg,DHBVDNA及DHBV病毒颗粒,转染鸭血清腹腔注射1d龄鸭可感染成功,转染鸭肝组织检测到复制型DHBVDNA,提示转染后既有抗原有的表达,又有病毒的复制。另外,用两种DHBVDNA单体质粒体内转染2dx 相似文献
103.
目的 研究人转化生长因子β1(TGFβ1)基因修饰对大鼠骨髓树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法 构建TGFβ1-pcDNA3质粒并转染未成熟DC。检测转染后DC的TGFβ1表达及其功能变化,输注1周后柃测TGFβ1-DC在受者脾和淋巴结的分布、T细胞凋亡水平及T细胞端粒酶表达。结果 TGFβ1-pcDNA3质粒转染DC能有效抑制DC的成熟和分化,并下调Dc的多种功能。TGFβ1基因转染不仅能降低DC对LPS的反应,同时抑制DC在MLR中刺激T细胞增殖的能力。TGFβ1-DC输注受者后,1周内可在脾和淋巴结内形成微嵌合,并有效诱导T细胞的凋亡,抑制T细胞端粒酶的活性和表达。结论 TGFβ1基因能有效抑制DC的多种功能,可用于诱导机体免疫耐受。 相似文献
104.
105.
106.
血管内皮生长因子反义基因转染对高转移人巨细胞肺癌细胞系生 … 总被引:1,自引:1,他引:1
目的 探讨反义血管内皮生长因子(VEGF)基因转染在抑制恶性肿瘤生长和转移的抗肿瘤血管基因治疗中的意义。方法 利用基因重组技术构建正义和反义VEGF121 cDNA真核表达载体,用脂质体法转染高转移性人巨细胞肺癌细胞(PG),经Northem杂交和Western印迹免疫化学检测VEGF mRNA和蛋白质的表达水平,并对转染前后细胞进行体外生长和裸鼠体内生长转移等多项生物学行为实验,结果 转染反义转 相似文献
107.
108.
酵母双杂合系统AD端阴离子交换蛋白C-末端表达质粒的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
利用PCR方法,从阴离子交换蛋白1(AE1)全长cDNA中扩增出约350bp c末端cDNA片段,测序后将其克隆至pGADT7载体上,用醋酸锂法构建好的pADT7-AE1-c末端转染酵母菌HA109,观察其在选择性培养基上的表达情况。结果表明,获得了530bp AE1c-末端cDNA,pGADT7-AE1-c末端对酵母无毒性,不能激活检测基因,可作为酵母双杂合系统中的靶基因。 相似文献
109.
以报告基因荧光素酶研究HPRE功能元件与IFN-α应答的关系 总被引:5,自引:0,他引:5
目的:以荧光素酶(luciferase,LUC)基因为报告基因,探讨HBV转录后调节序列(HPRE)的功能元件(α、β1和β2)对IFNα作用的影响。方法:用PCR法从载体pGEMluc中扩增LUC基因,并克隆入真核表达载体pcDNA3.0中。以含乙肝病毒(HBV)基因组的质粒A01为模板,扩增HPRE(完整的HPRE)、HPREαβ1及HPREβ1β2片段,并分别插入LUC基因的下游。利用脂质体介导的转染法,将重组质粒分别导入人肝癌细胞株HepG2中,用LUC检测系统检测IFNα作用前后LUC表达活性的变化。结果:经测序证实,重组质粒pcDNA3.0luc、pcDNA3.0lucHPRE、pcDNA3.0lucHPREαβ1及pcDNA3.0lucHPREβ1β2构建成功。检测结果显示,IFNα作用前,HPRE、HPREαβ1和HPREβ1β2均能提高LUC的活性,IFNα作用后,HPRE和HPREβ1β2能明显降低LUC的活性,而HPREαβ1对其表达则没有显著影响。结论:HPRE的功能元件β2与IFNα作用的关系最为密切,而功能元件α和β1在IFNα应答中作用甚小,提示IFNα诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白很可能是与β2结合的,为进一步研究IFNα在治疗HBV感染和慢性肝炎中的作用机制,以及HPRE抑制性结合蛋白的作用提供了一定的实验依据。 相似文献
110.