survivin、caspase-3在脑胶质瘤的表达及suvivin ASODN对U251细胞的影响

目的：观察脑胶质瘤患者脑组织survivin、caspase-3的表达情况及survivin ASODN对脑胶质瘤U251细胞survivin和caspase-3表达的影响,探讨两者与脑胶质瘤发病及预后的相关性。方法：免疫组化法检测脑胶质瘤患者survivin和caspase-3蛋白表达,RT-PCR检测脑胶质瘤组织survivin mRNA表达,以脑胶质瘤U251细胞为研究对象,转染不同剂量survivin ASODN（100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L）,并于培养不同时间（24h、48h、72h）后,RT-PCR检测U251细胞survivin和caspase-3的表达。结果：脑胶质瘤患者脑组织survivin蛋白高表达（阳性率69.6%）,而caspase-3低表达（阳性率50.7%）,且两者表达的阳性率与肿瘤的恶性程度有关。U251细胞在不同浓度survivin ASODN转染不同时间后,以500nmol/L survivin ASODN转染72h对U251 survivin mRNA的抑制率达62.06%,与对照组及不同浓度组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05-P〈0.01）。免疫组化结果显示转染后survivin表达下调,而caspase-3表达上调。结论：脑胶质瘤患者脑组织高表达survivin蛋白,而低表达caspase-3蛋白,survivin ASODN可诱导U251细胞株survivin mRNA及蛋白表达下调,而caspase-3蛋白表达水平上调。     

脂质体介导的c-myc反义硫代寡核苷酸诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的　探讨c myc反义硫代寡核苷酸 (antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotide ,APSODN)对胃癌SGC 790 1细胞凋亡的影响。方法　人工合成c mycAPSODN ,通过脂质体转染法处理人胃癌细胞系SGC 790 1后 ,于不同时间收集细胞 ,采用Northernblot、Westernblot检测c myc基因mRNA及蛋白表达 ,采用TUNEL方法检测凋亡指数 ,以流式细胞仪检测细胞周期。结果　TUNEL显示c mycAPSODN可诱导胃癌SGC 790 1细胞凋亡 ,并与APSODN的浓度和处理时间有关。流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G0 /G1期。结论　c mycAP SODN可诱导胃癌细胞凋亡。     

核因子-κB的反义及诱骗性寡核苷酸联合作用对内皮细胞间黏附分子-1表达的影响

目的探讨在人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)ECV304中,核因子(NF)-κB的反义及诱骗性寡核苷酸联合作用对肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的细胞间黏附分子-1(ICAM一1)表达的影响。方法采用反义和诱骗性寡核苷酸分别和联合干预ECV304,流式细胞仪检测寡核苷酸转染效率,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪荧光活细胞测定和免疫组织化学染色法分别从mRNA和蛋白质水平检测TNF-α诱导的ICAM-1表达。结果脂质体介导的转染法能有效地将单链、双链寡核苷酸转染至ECV304中。联合转染反义及诱骗性寡核苷酸的ECV304细胞的ICAM-1 mRNA表达较TNF-α诱导者降低42.58%(P<0.05),ICAM-1在细胞表面的表达降低85.46%(P<0.05),且下调幅度均显著大于反义寡核苷酸或诱骗性寡核苷酸的单独作用(P值均<0.01)。免疫组织化学染色也获得同样结果。结论NF-κB的反义及诱骗性寡核苷酸可显著下调NF-κB调控的与动脉粥样硬化相关的黏附分子表达,且联合作用效果强于单独作用,这可能为核苷酸干预防治动脉粥样硬化提供新的思路。     

bFGF反义寡核苷酸对大鼠肺成纤维细胞增殖信号通路的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸(AODN)对大鼠肺成纤维细胞增殖、转化信号通路的影响。方法:分离成年大鼠肺成纤维细胞,分为4组:对照组(未转染肺成纤维细胞);TGF-β1组(未转染肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+AODN组(转染AODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激);TGF-β1+RODN(正义寡核苷酸)组(转染RODN肺成纤维细胞+5ng/ml TGF-β1刺激)。每组设3复孔,并作细胞爬片,镜下计数肺成纤维细胞数量,绘制生长曲线。MTT比色法测定肺成纤维细胞增殖率。免疫细胞化学方法检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。通过ELISA法检测培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量。用RT-PCR法分析肺成纤维细胞Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、Ⅰ型胶原mRNA表达水平。结果:1细胞计数显示:TGF-β1+RODN组各时段成纤维细胞的数目均较对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组明显增多(P<0.05);TGF-β1+AODN组中成纤维细胞增殖数比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。2MTT结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞光密度值明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞光密度值明显比TGF-β1组减低(P<0.05)。3免疫细胞化学染色结果显示:TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞与对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组比较,α-SMA染色的平均光密度值(IOD)明显增加(P<0.05);TGF-β1+AODN组中肺成纤维细胞α-SMA染色的平均光密度值(IOD)比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。4 ELISA法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞培养液中bFGF、CTGF及Ⅰ型胶原蛋白含量比TGF-β1组明显减低(P<0.05)。5RT-PCR法检测结果显示:在TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显高于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad3mRNA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达明显比TGF-β1组明显减低(P<0.05);TGF-β1+RODN组肺成纤维细胞Smad7mRNA表达明显低于对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AODN组(P<0.05);TGF-β1+AODN组肺成纤维细胞Smad7 mRNA表达比TGF-β1组明显增加(P<0.05)。结论:bFGF反义寡核苷酸可抑制肺成纤维细胞的增殖、转化及胶原合成,bFGF反义寡核苷酸可能通过下调TGF-β1-Smad信号通路来发挥作用。     

反义脱氧寡核苷酸对SRS病毒复制的抑制作用

用合成的反义脱氧寡核苷酸,包括修饰的和非修饰的,同聚的和异聚的脱氧寡核苷酸对SRS病毒感染细胞的增殖、细胞群落形成,XC融合细胞产生的抑制作用。结果表明,上述的寡聚物对病毒都有抑制活性。各种寡聚物的作用机制不同。     

靶向抑制存活素表达对卵巢癌细胞株生物学行为的影响和意义

目的：通过存活素（ Survivin）反义寡核苷酸（ ASODN）转染人卵巢癌SKOV3细胞株抑制存活素Survivin蛋白表达,分析靶向抑制 Survivin 表达对卵巢癌细胞生长、细胞周期改变、凋亡、侵袭迁移能力的影响和意义。方法用脂质体（LipofectamineTM2000）介导Survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,通过四唑盐比色法（MTT法）分析细胞生长活性改变,通过流式细胞仪检测Survivin蛋白表达改变、细胞周期分布和细胞凋亡率,通过Transwell小室检测细胞侵袭迁移能力的改变。结果转染Survivin ASODN后卵巢癌细胞株中Survivin蛋白表达明显下降（t＝7．82,P＜0．01）。细胞生长明显减慢（F＝3．75,P＜0．01）,600nm/L ASODN转染48小时细胞存活率为49．50±20．76％,接近IC50值。细胞凋亡明显增加（t＝6．37,P＜0．05）,细胞增殖明显下降（t＝-10．35,P＜0．01）,更多的细胞停留在G0/G1期（t＝10．38,P＜0．01）。细胞迁移和侵袭能力下降（t值分别为19．26、27．42,均P＜0．01）。结论 Survivin ASODN通过靶向抑制卵巢癌细胞存活素表达,可抑制细胞生长,促进细胞凋亡,减少进入有丝分裂的细胞数,降低细胞的侵袭迁移能力,从而达到治疗卵巢癌的作用。靶向抑制存活素的治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段。     

HIF-1α反义寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α和p53表达的影响

目的：观察缺氧诱导因子HIF-1α反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASODN）在缺氧环境下对骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α和p53表达的影响。方法：设计针对HIF-1α亚基的mRNA反义和正义寡核苷酸（sense oligodeoxynucleotides,SODN）,并建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型,观察不同时相5μmol/L的HIF-1αASODN对骨肉瘤MG-63细胞HIF-1α和p53表达的影响。半定量RT-PCR方法检测HIF-1α和p53 mRNA的转录水平,免疫组化SP法和免疫印迹（Western blot）检测HIF-1α和p53蛋白表达情况。结果：与常氧组比较,单纯缺氧组及SODN缺氧组的蛋白表达水平随缺氧时间延长明显升高（P〈0.05）;而p53 mRNA以及蛋白的表达水平较常氧组均显著增强（P〈0.05）。在ASODN缺氧组,HIF-1α蛋白表达水平显著降低（P〈0.05）;p53 mRNA及其蛋白的表达水平也明显减弱（P〈0.05）。结论：缺氧可以通过诱导野生型p53的突变使HIF-1α稳定表达。而ASODN明显抑制HIF-1α的表达,且使突变型p53的表达水平显著下降,这说明HIF-1α可能在缺氧诱导野生型p53突变方面有一定的作用。     

影响PCR-RFLP的相关因素

限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, PCR-RFLP)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又称无细胞分子克隆技术.它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增.扩增后,将PCR产物直接酶切、电泳、显色,即可对目的基因进行分类分型.现将我做PCR-RFLP的体会简要陈述如下.     

TUSC3基因在胰腺癌组织中的表达

目的研究TUSC3基因在正常胰腺和胰腺癌组织中的表达水平。方法利用寡核苷酸基因芯片技术和实时定量PCR技术检测20例胰腺癌组织和6例正常胰腺组织中TUSC3基因的表达。芯片杂交结果进行Ratio值分析,实时定量PCR进一步验证杂交结果,PCR产物的定量方法采用比较Ct法。结果芯片扫描图像信号清晰,具有较低的整体背景和较高的信噪比。与正常胰腺组织相比,TUSC3基因在胰腺癌组织中表达下调,平均Ratio值为0．297±0．38。荧光定量PCR结果：TUSC3基因平均模板量在正常胰腺组织中为0．0387493±0．00965,胰腺癌组织中为0．0206028±0．00401;与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中TUSC3基因表达下调1．88倍（P〈0．05）。结论TUSC3基因在胰腺癌组织中表达水平明显下调,其可能机制与该基因启动子区过甲基化有关,TUSC3基因在胰腺癌发生发展中的生物学效应值得进一步研究。