蜂毒肽片段的合成及活性研究

为了保留蜂毒肽抗类风湿关节炎活性,降低溶血性和致敏性,设计合成蜂毒肽的片段,观察它对兔免疫性关节炎的治疗作用。采用多肽合成法合成蜂毒肽结构中亲水性片段,经高效液相色谱及质谱分析,确定合成多肽片段的氨基酸组成。建立家兔卵蛋白性关节炎模型,进行溶血性试验、致敏性试验以及动物模型治疗实验。结果:蜂毒肽片段溶血率<5%,致敏率<8%,动物模型治疗有效率可达到70%。实验证明蜂毒肽片段的合成可有效地保留蜂毒肽抗类风湿关节炎活性,减低蜂毒肽的强溶血活性及致敏活性。     

蜂毒肽与钙调蛋白

蜂毒肽是蜂毒中的主要成分,包括２６个氨基酸残基。由于它有分子量小,结构已知,与钙调蛋白高度亲和等优点,被认为是研究钙调蛋白的模型肽,对蜂毒肽－钙调蛋白复合物构象研究起步较早,但直到最近才有了较全面的结果。蜂毒肽对揭示钙调蛋白－靶酶作用的“翻转模式”机制,阐明其作用过程的构象变化都有重要作用。     

蜂毒肽片段的合成及其在治疗类风湿关节炎中的作用

为了保留蜂毒肽抗类风湿关节炎活性,降低溶血性和致敏性,设计合成蜂毒肽的片段,观察它对兔免疫性关节炎的治疗作用。采用多肽合成法合成蜂毒肽结构中亲水性片段,经高效液相色谱(HPLC)及质谱(MS)分析。建立家兔卵蛋白性关节炎模型,进行溶血性试验、致敏性试验以及动物模型治疗实验。结果蜂毒肽片段溶血率<5%,致敏率<8%,动物模型治疗有效率可达到70%。蜂毒肽片段可有效地保留蜂毒肽抗类风湿关节炎活性,减低蜂毒肽的强溶血活性及致敏活性。     

从蜂毒中分离纯化蜂毒肽的实验研究

为了建立一条适合国内采用的提取纯化蜂毒肽的工艺路线,本课题采用溶媒萃取、化学裂解和含与不含4mol／L脲的醋酸盐缓冲液的两次凝胶过滤柱层析的方法,可以从蜂毒中得到电泳纯的蜂毒肽,其静脉注射的LD50为4．0mg／kg,在试管内的HD50为8．0mg／L,在0．25mg／L时,即可使红细胞膜的流动性有明显增强。     

蜂毒肽对新生大鼠心肌细胞Na^＋,K^＋—ATP酶基因表达的影响

目的　观察蜂毒肽对新生大鼠培养心肌细胞Na ,K ATP酶α1和 β1亚基mRNA的表达。方法　采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术。药物与培养的心肌细胞温育 1h后 ,观察蜂毒肽对Na ,K ATP酶基因表达的影响。用GAPDHmRNA作为内参照。　结果　蜂毒肽对α1亚基mRNA表达有显著促进作用。经GAPDH校正 ,光密度值对照组为 0 .47± 0 .14(n =5 ) ,蜂毒肽 0 .0 1mmol/L组为 0 .6 6± 0 .10 (n =6 ,P <0 .0 5 ) ,哇巴因 1mmol/L组为 0 .6 7± 0 .0 9(n =6 ,P <0 .0 5 )。蜂毒肽 0 .0 1mmol/L组和哇巴因 1mmol/L组对Na ,K ATP酶β1亚基mRNA表达无显著影响。结论　蜂毒肽 0 .0 1mmol/L对Na ,K ATP酶α1亚基mRNA表达有促进作用 ,但对 β1亚基mRNA的表达无促进作用     

蜂毒肽对人神经胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用

目的 研究蜂毒肽对体外培养的入神经胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用.方法 MTT法检测蜂毒肽对两种人神经胶质瘤细胞(U87、U251)的增殖抑制率;流式细胞仪和凝胶电泳法检测蜂毒肽对两种肿瘤细胞的凋亡诱导作用.结果 蜂毒肽能够明显抑制两种细胞的生长(P＜0.05);浓度为1、10、20、40、80、160、200 mg/L的蜂毒肽诱导U87和U251细胞的凋亡率分别达到12.80%、16.92%、22.69%、34.05%、41.82%、59.87%、80.25%和11.61%、16.21%、22.03%、30.57%、41.10%、58.33%、79.12%,其诱导凋亡作用与剂量呈正相关.结论 蜂毒肽对人神经胶质瘤细胞具有明显的增殖抑制和促进凋亡作用.     

杂合肽CAMEm诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用

目的研究杂合肽(cecropinA-melittinhybridpeptidemutant,CAMEm)对鼻咽肿瘤细胞的诱导调亡作用。方法选取鼻咽癌CNE2细胞株为靶细胞,3T3细胞为正常细胞,以MTT比色法和Hoechest33342染色法,应用流式细胞仪和DNA凝胶电泳观察CAMEm对CNE2细胞的诱导调亡作用,检测杂合肽对CNE2细胞和3T3细胞生长抑制作用的时效和量效关系。结果与对照组相比,当5mg/LCAMEm作用12h时,抑制率升高,P<0·05;125mg/LCAMEm作用12h时,抑制率显著升高,P<0·01。0·5mg/L的CAMEm作用12h时,可以观察到调亡小体的产生;0·5、5、10和25mg/LCAMEm诱导CNE2细胞的调亡率分别达14·60%、17·42%、21·80%和36·10%,诱导调亡作用与剂量和时间呈明显正相关。CAMEm对3T3细胞没有显著影响。结论杂合肽CAMEm对CNE2细胞株具有明显诱导调亡作用,而且对正常细胞没有显著杀伤作用。     

蜂毒肽MP-1体外拮抗内毒素作用及其机制

目的 观察蜂毒肽MP-1的体外抗内毒素(LPS)活性并探讨其作用机制. 方法 应用生物传感器检测MP-1对类脂A(lipid A)的亲合力,采用动态比浊法鲎试验检测MP-1对LPS(2μg/L)的中和作用,激光扫描共聚焦显微镜观察不同浓度MP-1(5,10,20,40 μmol/L)干预后异硫氰酸荧光素标记LPS(FITC-LPS,100 μg/L)与小鼠RAW264.7细胞的结合,免疫细胞化学法观察MP-1对LPS(100μg/L)诱导的RAW264.7细胞TLR4表达的影响;实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测不同浓度MP-1作用下LPS(100μg/L)刺激的RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6基因及蛋白的表达;MTT法检测MP-1对RAW264.7细胞活力的影响. 结果 MP-1具有一定的结合lipid A及中和LPS的作用,在10 μmol/L浓度可显著抑制FITC-LPS与RAW264.7细胞结合(P<0.05),并对LPS刺激的小鼠RAW264.7细胞TLR4、TNF-α和IL-6的基因及蛋白表达有抑制作用(P<0.05或<0.01),该作用具有一定的剂量效应关系.MP-1体外实验浓度对细胞活力无影响(P>0.05). 结论 MP-1可能通过中和LPS作用,阻断LPS与RAW264.7细胞膜受体的结合,从而抑制LPS介导的细胞活化.     

蜂毒肽对大鼠主动脉收缩的作用及与钙内流的关系

为探讨蜂毒肽对心血管系统的作用机理,利用离体大鼠主动脉收缩实验及血管平滑肌细胞＾４５Ｃａ内流定量测定方法,观察了蜂毒肽对血管平滑肌的影响。结果发现：蜂毒肽不影响内皮完整主动脉由苯肾上腺素引起的快速收缩,但可溶度依赖地抑制持续收缩;蜂毒肽对去内皮主动脉环由苯肾上腺素引起的收缩无作用;蜂毒肽对内皮完整主动脉未能产生收缩反应,但可使去内皮动脉环产生收缩和＾４５Ｃａ内流增加,卡手普利和苄普地尔能部分拮抗这     

携蜂毒素基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含巨细胞病毒 (cytomegalovirus ,CMV)启动子或甲胎蛋白 (α fetoprotein ,AFP)调控序列驱动下的蜂毒素基因的重组腺病毒 ,进行体外抗肿瘤效果的比较。方法人工合成蜂毒素基因时 ,用Kozak序列优化翻译起始区 ,并进行人类最适密码子的转换 ,然后置于CMV启动子或AFP调控序列之后 ,用细菌内高效同源重组法构建腺病毒质粒 ,脂质体转染 2 93细胞进行包装。结果目的基因成功地重组人腺病毒质粒。结论上述蜂毒素 腺病毒载体构建时的几个特点 ,有助于载体的顺利构建 ,并为下一步的实验奠定了基础